BioAFM NanoWizard Совершенно Одетое для Изучать Микроорганизмы Аппаратурами JPK

Покрытые Темы

Введение
Нанотехнология для Микробиологии
Дрожди
Бактерии
Вирусы
Заключения
Подтверждения

Введение

Термина «микробиология» вообще описывает изучение тех организмов незримых к людскому глазу, в частности дрождям, бактериям и вирусам. Однако, эти 3 типа организмов отличал значительно один другого. Дрожди и бактерии различные типы клетки (eukaryotic и prokaryotic соответственно), тогда как вирус нет строго живущего организма, дармоедом обязывать внутриклеточным. Инструменты для того чтобы дирижировать исследование в микробиологии можно отделить в микроскопию 2 главную полей, которая необходимо для визуализирования, и молекулярная биология, которая была использована для того чтобы характеризовать (в некоторые случаи всесторонне) генетическое и proteomic составляет этих организмов.

Нанотехнология для Микробиологии

Инициативные шаг шаги в раскрывать поле микробиологии пришли с появлением первых микроскопов. Визуализировали Бактерии сперва Antony фургоном Leeuwenhoek, используя простой, собственн-построенный микроскоп, вокруг 1676. Микроскопы построенные Leeuwenhoek не были сложными микроскопами, полагаясь вместо на одиночном lense, больше как очень мощная лупа. Одно из его первых описаний бактерий (названных animalcules) было от образцов выскобленных от зубов фургона Leeuwenhoek себя.

Пока дрожди использованы в заквашивании и leaven хлеб на вокруг 5000 лет, они были в 1860 что Луи Пастер сперва описал дрожди, Saccharomyces Cerevisiae как effecter этих процессов. Луи Пастер сделал много значительно вкладов к полю микробиологии над летами, от описания S. cerevisiae, к его шикарным экспериментам для того чтобы опровергнуть теория самопроизвольно поколения и его основной роли в теории семенозачатка заболевания и предыдущего вакционного развития. В действительности, один из успехов Pasteur в поле вакционного развития было ослабить вирус бешенства через топление для впрыски как вакцина, несмотря на не мочь визуализировать вирус самого в трогнутой ткани.

Выдвижения сделанные в светлой микроскопии совмещенной работой Abbe Ernst и Карл Zeiss в 1880s более добавочно расширили исследование микробиологического мира. Однако, по мере того как описанный Abbe себя, предел к разрешению светлой микроскопии, зависимому на длине волны освещающего света и численной апертуры объектива. В реальности, разрешение светлой микроскопии ограничено до половина длины волны света, или вокруг 250 nm. Как таковой, изучение структуры вирусов должно ждать пришествие электронного кинескопа в 1931 Ernst Ruska и последующей кристаллизацией вируса мозаики табака в 1935 Wendall Стэнли.

Более недавно, атомный микроскоп усилия раскрыл новый путь для исследования и манипуляции структур на очень малом масштабе. Одно из наиболее часто цитируемых преимуществ AFM в изучении биологических структур факт что, не похож на электронную микроскопию, высокие изображения разрешения можно получить под физиологопсихологическими условиями. Однако, больше к AFM чем как раз своя емкость для высокого воображения разрешения. Механически природа AFM значит что cantilever, используемый для воображения, можно также использовать для того чтобы измерить усилия взаимодействия, в ряде piconewton.

Как таковой, не только может изображение AFM поверхность микроорганизмов на высоком разрешении, под физиологопсихологическими условиями, оно можно также использовать для того чтобы расследовать силы связи между микроорганизмами и поверхностями цели.

JPK Nanowizard® BioAFM совершенно одето к таким изучениям. Nanowizard® конструировано для работы одновременной с светлой микроскопией, и установлено на перевернутый светлый микроскоп, позволяющ множественным каналам информации быть собрано и уменьшающ экспириментально время путем позволять пользователю определить расположение клеток интереса оптически, перед просматривать определенную зону с AFM. Специально конструированный держатель образца, JPK BioCell™, облегчает эксперименты на температурах между 15-60°C на тонких стеклянных coverslips, такими что качество оптически изображений в не уменьшено. В добавлении, JPK Nanowizard® показывает главную стабилность, позволяющ высокому воображению разрешения компонентов клетки, как бактериальные поверхностные слои (Диаграмма 1) так же, как физиологопсихологическое воображение всех клеток, от prokaryotes к эукариотам.

Диаграмма 1. слой от radiodurans Deinococcus, изображение HPI добросердечно обеспеченное Др. Патриком Frederix, Университетом Базеля.

Дрожди

Cerevisae дрождей S., известные также как отпочковываясь дрожди, не только пользы в промышленных процессах от делать хлеба к заваривать пива, его также тип организм в изучении eukaryotic клеток. По Мере Того Как S. cerevisiae способен haploid или диплоидного роста и одноячеистый организм с периодом сдваивания несколько часов, он доказывал хорошо - одето к изучению основной действовать eukaryotic клеток.

Дрожди S. cerevisiae окружены клеточной оболочкой составленной протеинов, полисахаридов и небольших количеств хитина. Электронная микроскопия показывала что эта клеточная оболочка наслоенная структура колебаясь до 300 nm толщиной. Внутренний слой одалживает механически прочность и составлен â1,2-glycan и хитина. Наружный слой включается в случаи опознавания между клетками, и главным образом составлен тяжело glycosylated mannoproteins. Присутсвие сторон-цепей углевода на этих mannoproteins делает клеточную оболочку гидрофильным и приводит к в множественных отрицательных зарядах на физиологопсихологическом PH. Когда imaged с AFM, поверхность клетки кажется очень ровной, и легко деформирована, требуя тщательную скеннирование на минимальном усилии (Диаграмме 2). Единственная ясная поверхностная характеристика шрам бутона на другой конец клетки матери к заново формируя клетке дочи. Поверхность кажется ровной как сахары затемняет мембрану.

Диаграмма 2. Воображение S. cerevisiae. Клетки Дрождей были расположены используя микроскопию DIC (A) и после этого imaged в режиме контакта в жидкости с AFM (B). В (C) изображении 3D произведенном от канала высоты показывает, выделяющ шрам бутона на клетке матери (желтая стрелка.)

Одна из уникально характеристик AFM запруживает от механически природы самой микроскопа. Гибкий cantilever можно откалибрировать и затем использовать для того чтобы высчитать усилия взаимодействия. Это можно после этого использовать для того чтобы определить и усилие взаимодействия между образцом и cantilever, и длина к которому поверхностные элементы протянет прежде чем будет повреждано соединение к cantilever.

Здесь, мы касались друг друга cantilever с несколькими пунктов на поверхности как матери, так и клетки дочи. Хотя бы 10 кривых усили-расстояния были получены на множественные этапы для каждой клетки.

От кривых усили-расстояния, различные данные можно извлечь. В Диаграмме 3, только одна из кривых удлинять (как cantilever причаливает поверхности и деформирует) было прокладывать курс в красном цвете. Другое изгибает все соответствует к retrace, или стягиванию cantilever далеко от поверхности. Во Время этого участка стягивания, если поверхностный элемент прыгал к cantilever, то cantilever отклонит вниз как piezo движения обломок держа cantilever далеко от поверхности. По Мере Того Как cantilever отклонятьет вниз усилие прикладное к поверхностному элементу прикрепленному к cantilever увеличит. На усилии на котором скрепление между биомолекулой и cantilever сломленно, cantilever щелкнет назад к своему non-отклоненному положению.

Диаграмма 3. кривые Усили-Расстояния взаимодействия между cantilever и поверхностью дочи (A) или клетки матери (B). В красном цвете кривый удлинять, все другие втягивает кривые. Maximal unbinding усилие (F) и расстояние разъединения (D) можно высчитать от этих данных. Голубая стрелка показывает зону кривого которая признакова эластичный протягивать молекул.

Форма раздела втягивать кривых усили-расстояния может также показать что-то о материальных свойствах прикрепленной биомолекулы. В этот случай форма кривого показывает что поверхностные элементы прикрепленные к cantilever деформируют эластично, прежде чем взаимодействие с cantilever сломленно. Дополнительно, от этого retrace кривый одно смогите определить усилие требуемое, что сломать скрепление и расстояние разъединения от поверхности на которой это скрепленное нарушение происходит.

Изменчивость между кривыми усили-расстояния полученными на такой же клетке, должной к факту что не каждое взаимодействие между cantilever и поверхностью клетки приведет к в приложении биомолекулы к cantilever, cantilever всегда не будут прикрепляться к концу молекулы и поверхностный состав по существу несродн. Поэтому важно приобрести достаточное количество кривых усили-расстояния так, что данным можно эффектно подвергнуть к статистическому анализу. Здесь, над 100 кривыми усилия измерил на каждой клетке, и maximal unbinding усилие, F, и расстояние на повреждении, D разъединения, были высчитаны и в Диаграмме 4 как гистограмма. Значения F и D только были высчитаны когда было обнаружено взаимодействие между поверхностной молекулой и cantilever.

Диаграмма 4. Гистограммы выдвижения дистанцирует D (A) и maximal unbinding усилие F (B) для клеток матери и дочи.

В случае расстояния к повреждению, гистограмма значений показывает что для обеих клеток данные нормально распределены до 400 nm (Смоква 4A), и после этого для обеих клеток некоторые более большие останцы. Для того чтобы сравнить 2 набора данных были пренебрежены останцы над 400 nm. В Пределах этих ограничений, для клетки матери D = 139 ± 56 nm, и для клетки дочи D = 86 ± 43 nm. Были определены, что были Эти значения значительно различны, используя 2-замкнутое T-Испытание студента.

На данные для maximal unbinding усилия показано что, на среднем, unbinding усилие для клетки матери более высоко чем усилииз клетки дочи (матери, F = 352 pN: дочь, F = 167 pN). Однако, в этот случай, гораздо обширнее распределение unbinding усилий и в оба случая, были несколько кривых усили-расстояния где было никакое отклонение cantilever, т.е. никакая вязка поверхностных молекул к cantilever (Диаграмме 4B). Эти данные предлагают разницу в структуре и составе клеточной оболочки между матерью и клеткой дочи.

Бактерии

По Мере Того Как AFM поверхностный метод воображения, он был использован для того чтобы характеризовать поверхностные структуры на высоком разрешении. Некоторые бактерии показывают Убивателю, или поверхностному слою, состоя из регулярно, котор пакуют решетки протеина. Упаковка одалживает структурную стабилность к образцу, так изолированным, кристаллическим Убивателям может быть imaged на высоком разрешении, субблоках протеина показа индивидуальных. Шестиугольно упакованный промежуточный слой от radiodurans Deinococcus archaebacteria (Диаграмма 1) известный пример. В изображениях AFM этого слоя HPI, можно увидеть индивидуальные субблоки каждой поры, и что некоторые из этих пор в открытой конформации, пока другие закрыто.

Пока большинств Убиватели экспоната archaebacteria, напряжения лаборатории eubacteria вообще не делают. Наиболее обыкновенно используемые бактерии лаборатории Eschericia coli, грамотрицательные бактерии. Грамотрицательные бактерии имеют мембрану плазмы, окруженную periplasmic космосом в которой твердая но сильно пористая клеточная оболочка peptidoglycan. Это после этого окружено наружной мембраной, от которой lipopolysaccarides меняя длины удлиняют.

Диаграмма 5. Прерывистые изображения режима контакта клеток DH5a. Изображения высоты (A) и сигнала ошибки Обзора (B), и более высокого изображение сигнала ошибки увеличения (C) поверхности бактерии.

Здесь, мы имеем imaged 2 напряжения Escherichia Coli, DH5a и OP50. Изображения DH5a показывают классику, штанг-форму много грамотрицательных бактерий. Клетки были просмотрены в воздухе (Диаграмме 5) и в буфере (Диаграмме 6). Когда imaged в воздухе, поверхность бактерий кажется сильно сделанной по образцу. В добавлении, венчик вокруг бактерии ясн. Эти структуры вероятно соответствуют к pili, которые найдены на поверхности Escherichia Coli. В контрасте, когда imaged в жидкости (Диаграмма 6) поверхность бактерии кажется гораздо ровне. В этот случай это должно к факту что поверхностные структуры легко были смещены движением подсказки во время скеннирования, по мере того как они не зафиксированы в месте.

Диаграмма 6. Прерывистые изображения режима контакта DH5a в жидкости. Показаны изображение 3D произведенное от топографических данных (A) и более высокое изображение сигнала ошибки увеличения (B).

Напряжение OP50, пока также Escherichia Coli, кажется довольно другим. OP50 первоначально было изолировано как напряжение которое смогло быть использовано для того чтобы подать elegans Caenorhabditis. Это урацил требуя напряжения которое более утло и более мало чем другие напряжения Escherichia Coli. Когда imaged в воздухе (Диаграмма 7) эти бактерии не показывает такую же составленную поверхность как увидено для DH5a. В добавлении, клетки более утлы и должны быть осторожным imaged во избежание извлечь их от поверхности. В жидкости, поверхность также более менее составлена чем то из DH5a, и зоны поверхности клетки смещены в направлении сканирования, правоподобном соответствие к смещению сахаров и других гибких структур на поверхности клетки.

Диаграмма 7. Изображения бактерий OP50 imaged в воздухе (-Топографии, сигнале Berror) и жидкости (топографии C-, сигнале ошибки D-).

Cantilever можно также использовать для того чтобы зондировать взаимодействия с сахарами на поверхности бактерий (как показан для вышеуказанного S. cerevisiae). Однако, здесь мы прикрепляли бактерии к cantilever (используя поли-L-лизин) и измеряли взаимодействию между бактериями и поверхностью слюды (Диаграммой 8). Такой метод уникально в что он позволяет квантификации взаимодействий бактериальн-поверхности, критическо для изучений biofouling в промышленных процессах. Польза JPK Biocell™ как держатель образца позволяет в добавлении situ смесей преградить эти взаимодействия.

Диаграмма 8. Репрезентивные curvers усили-расстояния взаимодействия между консольн-пределом DH5a и поверхностью слюды, в буфере. Кривый удлинять в красном цвете, все голубые кривые кривые стягивания. Увеличивать прикладное усилие не увеличил maximal unbinding усилие. Стрелки показывают индивидуальные unbinding случаи.

Репрезентивные кривые усили-расстояния взаимодействий DH5á-mica в Диаграмме 8. По сравнению с взаимодействием cantilever с поверхностью S. cerevisiae, там никакая упругая деформация образца. Несколько дискретных unbinding случаев можно увидеть, правоподобно соответствие к unbinding индивидуальных поверхностных элементов. Опять, от кривых одного расстояния усилия смогите квантифицировать максимальное усилие требуемое, что отделить бактерии от поверхности, тем ме менее одно может также начать расследовать индивидуальные unbinding случаи.

Вирусы

Вирусы обязывают внутриклеточных дармоедов составленных материала наружного пальто протеина окружающего генетического который состоит из или ДНА или РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ. Этот генетический материал не содержит всю информацию необходим для репликации, вместо вирусу нужно ниспровергнуть клетчатое машинное оборудование ведущей ячейки для того чтобы распространить. Вирусы весьма малы, вокруг 20 nm до 400 nm. Это значит что характеризация вирусной структуры требует высоких методов воображения разрешения, как атомная микроскопия усилия. Здесь мы имеем imaged вирус мозаики табака (TMV), первый вирус imaged используя электронную микроскопию.

Диаграмма 9. Прерывистые изображения режима контакта частиц TMV. Топография (A), участок (B) и изображения сигнала ошибки (C) такой же зоны образца.

Частицы TMV были адсорбированы к слюде и imaged используя прерывистый режим контакта. Эти частицы вируса как спиральные capsids, где стога протеина пальто в спиральной картине вокруг генетического материала. Этот спиральный штабелировать можно увидеть в каналах высоты, участка и сигнала ошибки (Диаграмме 9). Одно значительно преимущество использования BioAFM, как JPK Nanowizard®, к образцам изображения биологическим, что воображение можно дирижировать в жидкости. Как таковой, частицы вируса могут быть imaged на поверхности их клеток цели, в жидкости. Здесь, мы имеем imaged вирус гриппа прикрепленный к поверхности клеток крови, в жидкости, используя прерывистый режим контакта. Частицы вируса ясно imaged на поверхности клеток.

Диаграмма 10. частицы Вируса гриппа связанные с поверхностью эритроцита. Изображение обзора (A) и более высокое изображение увеличения (B) частиц вируса гриппа выставки поверхности клетки крови (белая стрелка)

Заключения

BioAFM Nanowizard® совершенно одето для изучения микроорганизмов. JPK Biocell обеспечивает физиологопсихологические условия без жертвовать стабилность AFM или оптически качество. Стабилность микроскопа включает воображение индивидуальных субблоков протеина, и полное внедрение в перевернутый светлый микроскоп позволяет методы микроскопии сочетание из быть дирижированным одновременно. Не только эта платформа позволяет высоким изображениям разрешения микробных образцов, ее можно использовать для того чтобы квантифицировать усилия взаимодействия между организмами и поверхностью или между cantilever и поверхност-связанными молекулами.

Подтверждения

Большого Спасибо к Др. Джеффри Stear, Институту Макса Planck для Молекулярных Биологии и Генетики Клетки, для образцов Escherichia Coli и S. cerevisiae. TMV добросердечно было обеспечено Др. Майкл Laue от Института Роберта Koch. Изображения HPI добросердечно были обеспечены Др. Патриком Frederix, Университетом Базеля.

Источник: Аппаратуры JPK

Для больше информации на этом источнике пожалуйста посетите Аппаратуры JPK

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:23

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit