NanoWizard bioAFM som Passas Perfekt för Att Studera Microorganisms av JPK, Instrumenterar

Täckte Ämnen

Inledning
Nanotechnology för Microbiology
Jäst
Bakterier
Virus
Avslutningar
Tack till personer

Inledning

Benämna ”microbiology” beskriver allmänt studien av de organismer som är osynliga till människan, synar, i synnerhet jäst, bakterier och virus. Emellertid är dessa tre typer av organismer markant olika från varje annan. Jäst och bakterier är olika celltyper (eukaryotic och prokaryotic respektive), eftersom en virus inte är strängt en bosatt organism som är en intracellular parasit för obligate. Bearbetar för att föra forskning i microbiology kan avskiljas in i microscopy för två huvudsaklig fält, som krävs för visualization, och molekylär biologi, som har varit van vid, karakteriserar (i vissa fall omfattande) det genetiska och proteomic sminket av dessa organismer.

Nanotechnology för Microbiology

Det initialt kliver, i att öppna sätta in av microbiology, kom med adventen av de första mikroskopen. Bakterier visualiserades först av Antony skåpbil Leeuwenhoek, genom att använda ett enkelt själv-byggt mikroskop, omkring 1676. Mikroskopen som byggdes av Leeuwenhoek, var inte sammansatt mikroskop som i stället relying på en singellense, mer något liknande ett mycket kraftigt förstoringsglas. En av hans första beskrivningar av bakterier (som sågs till som animalcules) var från tar prov skrapat från de själva tänderna av skåpbil Leeuwenhoek.

Stundjäst har använts i jäsning, och att leaven bröd för omkring 5000 år var det i 1860, att Louis Pasteur beskrev först jästen, Saccharomyces Cerevisiae, som effecteren av dessa bearbetar. Louis Pasteur gjorde många viktiga bidrag till sätta in av microbiology över åren, från beskrivningen av S. som var cerevisiae, till hans eleganta experiment för att disprove teorin av den spontana utvecklingen och hans grundroll i bakterieteorin av sjukdom- och tidig sortvaccinutveckling. I faktum var en av Pasteurs framgångar i sätta in av vaccineraa utveckling att göra smal rabiesviruset till och med uppvärmning för injektionen som ett vaccin, illviljan som den inte-är kompetent att visualisera viruset sig själv i det upprörda silkespappret.

Befordringar som gjordes i ljus microscopy av det kombinerade arbetet av den Ernst Abben och Carl Zeiss i 1880sna fördjupa vidare, forskningen av den mikrobiologiska världen. Emellertid som självt beskrivit för Abbe, finns det en begränsa till upplösningen av ljus microscopy, anhörig på våglängden av den upplysande ljusa och numeriska öppningen av linsen. I verkligheten begränsas upplösningen av ljus microscopy till halvan våglängden av ljust eller omkring 250 nm. Som sådan, studien av strukturera av virus måste väntan för adventen av elektronmikroskopet i 1931 av Ernst Ruska och den följande kristalliseringen av tobakmosaikviruset i 1935 av Wendall Stanley.

För en tid sedan, har det atom- styrkamikroskopet öppnat en ny bana för utredningen, och behandlig av strukturerar på ett mycket litet fjäll. En av de oftast citerade fördelarna av AFMEN i studien av biologiskt strukturerar är faktumet som, i motsats till elektronmicroscopy, kickupplösning avbildar kan erhållas under fysiologiskt villkorar. Emellertid finns det mer till AFMEN än precis dess kapacitet för att avbilda för kickupplösning. Den mekaniska naturen av AFM-hjälpmedlet, som cantileveren som används för att avbilda, kan också vara van vid, mäter växelverkanstyrkor, i piconewtonen spänner.

Som sådan, inte endast kan AFMEN avbilda ytbehandla av microorganisms på kickupplösning, under fysiologiskt villkorar, det kan också vara van vid utforskar de bindande styrkorna mellan microorganisms och uppsätta som mål ytbehandlar.

JPKEN Nanowizard® BioAFM passas perfekt till sådan studier. Nanowizard®en planläggs för att fungera samtidigt med ljus microscopy och installeras på ett inverterat ljust mikroskop som låter multipel, kanaliserar av information som ska samlas, och förminskande experimentell tid, genom att låta användaren identifiera läget av celler av, intresserar optiskt, innan den avläser en särskild region med AFM. Som planläggs special tar prov hållaren, JPKEN BioCell™, gör experiment lättare på temperaturer mellan 15-60°C på tunna glass coverslips som är sådan att det kvalitets- av optiskt avbildar i inte förminskande. I tillägg stabiliteten för utställningar för JPK Nanowizard® ytbehandlar den överlägsna och att låta att avbilda för kickupplösning av celldelar, liksom bakterie- lagrar (Figurera 1) såväl som fysiologiskt avbilda av hela celler, från prokaryotes till eukaryotes.

Figurera 1. HPI-lagrar från Deinococcus radiodurans, avbildar vänligen förutsatt att av Dr. Patrick Frederix, Universitetar av Basel.

Jäst

Cerevisaena för jäst som S. är bekant också som spirande jäst, är inte endast av bruk i industriellt bearbetar från bröddanande till brygga av öl, det är också en typorganism i studien av eukaryotic celler. Som cerevisiae S. är kapabelt av haploid eller diploid tillväxt och är en singelcellorganism med en dubblera tid av en koppla ihop av timmar, har det bevisat väl - passat till studien av grundläggande fungera av eukaryotic celler.

Den cerevisiae jästen S. omges av en cellvägg som komponeras av proteiner, polysaccharides och lilla belopp av chitin. Elektronmicroscopy har visat att denna cellvägg är ett i lagert strukturerar att spänna upp till 300 nm tjockt. Det inre lagrar lånar mekanisk styrka och komponeras av â1,2-glycan och chitinen. Det yttre lagrar är involverat i erkännandehändelser mellan celler och komponeras mestadels av tungt glycosylated mannoproteins. Närvaroen av kolhydratet sida-kedjar på dessa mannoproteins gör cellväggen hydrophilic och resultat i multipelnegationladdningar på fysiologisk pH. När det avbildas med AFM, visas ytbehandla av cellen slätar mycket och deformeras som lätt necessitating försiktig scanning på minsta styrka (Figurera 2). Det enda påtagligt ytbehandlar särdrag är knoppärret på motsatsen avslutar av fostracellen till bilda den nyligen dottercellen. Ytbehandla visas slätar, som sockrar oklart membranet.

Figurera 2. Avbilda av S. som är cerevisiae. Jästceller lokaliserades genom att använda DIC-microscopy (A) och avbildades därefter i kontaktfunktionsläge i vätska med AFMEN (B). I (C) en 3D avbilda frambragt från höjden kanaliserar visas och att markera knoppärret på fostracellen (den gula pilen.)

Ett av de unika särdragen av AFMEN stems från den mekaniska naturen av mikroskopet sig själv. Den böjliga cantileveren kan kalibreras, och därpå van vid beräkna växelverkanstyrkor. Detta kan därefter vara van vid bestämmer både styrkan av växelverkan mellan en ta prov och cantileveren, och längden till som ytbehandlar, sträcker ska beståndsdelar, för anknyta till cantileveren bristas.

Här har vi kommit med cantileveren in i kontakt med ett nummer av pekar på ytbehandla av både fostra och dottercellen. 10 Åtminstone styrka-distanserar buktar erhölls på multipeln pekar för varje cell.

Från styrka-distansera buktar, olika data kan dras ut. I Figurera 3, buktar har endast en av fördjupningen (som cantileveren att närma sig ytbehandla och deformerar), konspirerats i rött. Alla annat buktar motsvarar till se över igen eller tillbakadragning av cantileveren i väg från ytbehandla. Under denna tillbakadragning arrangera gradvis, om en ytbehandlabeståndsdel har destinerat till cantileveren, den ska cantileveren avböjer nedåt som de piezo flyttningarna gå i flisorinnehav cantileveren i väg från ytbehandla. Som cantileveren avböjer nedåt styrkan som appliceras till ytbehandlabeståndsdelen som fästas till cantileveren ska förhöjningen. På styrkan, som förbindelsen mellan biomoleculen och cantileveren är bruten på, placerar denavböjda cantileveren ska plötsliga baksidaen till dess.

Figurera 3. Styrka-Distansera buktar av växelverkan mellan cantileveren och ytbehandla av dottern (A) eller fostrar cell (B). I rött är fördjupningen buktar, alla andra är drar tillbaka buktar. Den maximala unbinding styrkan (F) och avskiljandet distanserar (D) kan beräknas från dessa data. Blåttpilen indikerar regionen av bukta som är indikativen av resårsträckning av molekylarna.

Forma av tillbakadragningen delar upp av styrka-distansera buktar kan också indikera något om den materiella rekvisitan av den fäste biomoleculen. I detta fall visar forma av bukta att ytbehandlabeståndsdelarna som fästas till cantileveren deformerar elastiskt, för växelverkan med cantileveren är bruten. Dessutom från detta se över igen buktar en kan bestämma styrkan som krävs för att bryta förbindelsen och distansera av avskiljandet från ytbehandla som denna förbindelsesöndring uppstår på.

Det finns variability mellan styrka-distansera buktar erhållande på den samma cellen, tack vare faktumet, att inte varje växelverkan mellan cantileveren och cellen ytbehandlar ska resultat i tillbehöret av en biomolecule till cantileveren, cantileveren ska inte alltid bilagan till avsluta av en molekyl, och ytbehandlasammansättningen är naturligt heterogen. Det är därför viktigt att få ett tillräckligt numrerar av styrka-distanserar buktar, så att datan kan effektivt betvingas till statistisk analys. Här över 100 som styrka buktar, mättes på varje cell, och den maximala unbinding styrkan, Fet och avskiljandet distanserar på brister, D, beräknades och framläggas in Figurerar 4 som ett histogram. Värderar F, och D beräknades endast, då växelverkan mellan en ytbehandlamolekyl och cantileveren avkändes.

Figurera 4. Histogram av f8orlängningen distanserar D (A) och maximal unbinding styrka F (B) för fostra och dottercellerna.

I fallet av distansera som ska bristas, värderar histogrammet av, visar att för båda celler som datan är normalt utdelade upp till 400 nm (Figen 4A), och därefter för båda celler finns det några större outliers. För att jämföra de två datamängderna ignorerades outliersna ovanför 400 nm. Inom dessa tvång, för fostracellen D = 139 ± 56 nm och för dottercellen D = 86 ± 43 nm. Dessa värderar var beslutsamma att vara markant olika, genom att använda entailed deltagare T-Testar.

Datan för den maximala unbinding styrkan visar, att, i genomsnitt, den unbinding styrkan för fostracellen är högre än det av dottercellen (fostra, F = 352 pN: dotter F = 167 pN). Emellertid i detta fall, finns det en mycket mer bred fördelning av unbinding styrkor, och i båda fall, fanns det ett nummer av styrka-distanserar buktar var det inte fanns någon avböjning av cantileveren, dvs. ytbehandlar inget band av molekylar till cantileveren (Figurera 4B). Dessa data föreslår en skillnad i strukturera och sammansättningen av cellväggen mellan fostra och dottercellen.

Bakterier

Som AFM är en ytbehandla som avbildar teknik, har den varit van vid karakteriserar ytbehandlar strukturerar på kickupplösning. Några bakterier ställer ut ettLagrar eller ytbehandlar lagrar som består av ett regelbundet packat galler av protein. Emballaget lånar en strukturell stabilitet till ta prov, så isolerade crystalline Slayers kan avbildas på kickupplösning, under-enheter för visningindividprotein. Det sexhörnigt packade mellanliggande lagrar från de archaebacteriaDeinococcus radioduransna (Figurera 1), är ett välkänt exempel. I AFM avbildar av detta HPI-lagrar, kan ett se individsubunitsna av varje por, och, att några av dessa por är i en öppen gestaltning, är stunder andra stängda.

Stunden mest archaebacteriautställningsS-Lagrar, laboratorium anstränger av eubacteria gör allmänt inte. De mest gemensam använda laboratoriumbakterierna är Eschericia coli, ett gram - negationbakterier. Gram - negationbakterier har ett plasmamembran som omges av ett periplasmic utrymme i som det, finns en styv men högt porös cellvägg av peptidoglycan. Detta omges därefter av ett yttre membran, som lipopolysaccarides av den varierande längden fördjupa från.

Figurera 5. Det Intermittent kontaktfunktionsläget avbildar av DH5a-celler. Överblickhöjd (A) och felet signalerar (B) avbildar, och ett högre förstoringsfel signalerar avbildar (C) av ytbehandla av bakterien.

Här har vi avbildat två anstränger av Escherichia Coli, DH5a och OP50. Avbildar av DH5a-show klassikern, stång-Shape av många gram - negationbakterier. Cellerna avlästes in luftar (Figurera 5) och fungera som buffert in (Figurera 6). När du avbildas in, lufta, ytbehandla av bakterierna verkar högt mönstrat. I tillägg är en gloria runt om bakterien påtaglig. Dessa strukturerar motsvarar troligen till pilien, som finnas på ytbehandla av Escherichia Coli. I kontrast när det avbildas i vätska (Figurera 6), verkar ytbehandla av bakterien mycket slätare. I detta fall är detta tack vare faktumet som ytbehandla strukturerar skulle förflyttas lätt av rörelsen av spetsen under scanning, som de inte fixas in förlägger.

Figurera 6. Det Intermittent kontaktfunktionsläget avbildar av DH5a i vätska. En 3D avbildar frambragt från topographic data (A), och ett högre förstoringsfel signalerar avbildar (B) visas.

OP50NA anstränger, fördriver också Escherichia Coli, verkar ganska olika. OP50 isolerades ursprungligen som en anstränga som kunde vara van vid matningsCaenorhabditis elegans. Den är kräva för uracil anstränger, som är bräckligare och mindre, än annat Escherichia Coli anstränger. När du avbildas in, lufta (Figurera 7), dessa bakterier ställer ut inte strukturerade samma ytbehandlar som sett för DH5aen. I tillägg är måste cellerna bräckligare och försiktigt avbildas för att undvika att ta dem bort från ytbehandla. I vätska struktureras ytbehandla också mindre än det av DH5a, och regioner av cellen ytbehandlar förflyttas i bildläsningsriktningen som troligen motsvarar till förskjutningen av, sockrar, och annat böjligt strukturerar på ytbehandla av cellen.

Figurera 7. Avbildar av bakterier som OP50 in avbildas, luftar (En-Topografi, signalerar Berror) och vätska (C-topografi, D-fel signalerar).

Cantileveren kan också vara van vid sondväxelverkan med sockrar på ytbehandla av bakterierna (som visat för cerevisiae ovannämnt för S.). Emellertid här har vi fäst bakterierna till cantileveren (som använder poly-L-lysine), och mätt växelverkan mellan bakterierna och micaen ytbehandla (Figurera 8). En Sådan teknik är unik det låter däri quantificationen av bakterie--ytbehandlar växelverkan som är kritiska för studier av biofouling i industriellt, bearbetar. Bruket av JPKEN Biocell™ som en ta provhållare låter i situtillägg av sammansättningar till kvarteret dessa växelverkan.

Figurera 8. Representativt styrka-distansera curvers av växelverkan mellan cantilever-destinerad DH5a och en mica ytbehandla, fungera som buffert in. En fördjupning buktar framläggas i rött, alla blått buktar är tillbakadragning buktar. Ökande gjorde den applicerade styrkan inte förhöjning den maximala unbinding styrkan. Pilar indikerar unbinding händelser för individ.

Representativt styrka-distansera buktar av DH5á--micaväxelverkan framläggas in Figurerar 8. I jämförelse med växelverkan av cantileveren med det cerevisiae S.et ytbehandla, där är ingen resårdeformering av ta prov. Ett nummer av åtskilda unbinding händelser kan ses och troligen att motsvara till unbindingen av individen ytbehandlar beståndsdelar. Igen från styrkan distansera buktar en kan kvantifiera maximat styrka som krävs för att avskilja bakterierna från ytbehandla, however en kan också starta att utforska unbinding händelser för individ.

Virus

Virus är obligate intracellular parasit som komponeras av ett yttre protein, täcker omgeende genetiskt materiellt som består av endera DNA eller RNA. Detta genetiska materiellt innehåller inte alla information som krävs för replication, viruset, behöver i stället att subvert det cell- maskineriet av vara värdcellen för att fortplanta. Virus är extremt lilla, omkring 20 nm till 400 nm. Detta kräver hjälpmedlet, att characterisationen av virus- strukturerar, kickupplösning som avbildar tekniker, liksom atom- styrkamicroscopy. Här har vi avbildat tobakmosaikviruset (TMV), den första avbildade viruset genom att använda elektronmicroscopy.

Figurera 9. Det Intermittent kontaktfunktionsläget avbildar av TMV-partiklar. Topografi (A), arrangerar gradvis (B), och felet signalerar avbildar (C) av samma tar prov region framläggas.

TMV-partiklarna adsorberades till mica och avbildades genom att använda intermittent kontaktfunktionsläge. Dessa viruspartiklar är bekant som spiralformiga capsids, var täckaproteinbuntarna i ett spiralformigt mönstrar runt om det genetiska materiellt. Detta spiralformiga stapla kan ses i höjden, arrangerar gradvis, och felet signalerar kanaliserar (Figurera 9). En viktig fördel av att använda en BioAFM, liksom JPKEN Nanowizard®, för att avbilda biologiskt tar prov, är att avbilda kan föras i vätska. Som sådan, kan viruspartiklar avbildas på ytbehandla av deras uppsätta som mål celler, i vätska. Här har vi avbildat influensaviruset som fästas till ytbehandla av röda blodceller, i vätska, genom att använda intermittent kontaktfunktionsläge. Viruspartiklarna avbildas klart på ytbehandla av cellerna.

Figurera 10. Influensaviruspartiklar som är tillhörande med ytbehandla av en erythrocyte. Överblicken avbildar (A), och högre förstoring avbildar (B) av den röda blodcellen ytbehandlar partiklar för showinfluensaviruset (vitpil)

Avslutningar

Den Nanowizard® bioAFMen passas perfekt för studien av microorganisms. JPKEN Biocell ger fysiologiskt villkorar, utan att offra AFM-stabilitet eller optiskt kvalitets-. Stabiliteten av mikroskopet möjliggör att avbilda av individproteinsubunits, och full integration in i ett inverterat ljust mikroskop möjliggör en kombination av microscopytekniker som ska föras samtidigt. Inte endast låter denna plattform kickupplösning avbildar av mikrobiellt tar prov, kan den vara van vid kvantifierar växelverkanstyrkor mellan organismer och en ytbehandla eller mellan cantileveren och detillhörande molekylarna.

Tack till personer

Många tack till Dr. Jeffrey Stear, det Max Planck Institutet för Molekylär CellBiologi och Genetik, för det cerevisiae Escherichiaet Coli och S.et tar prov. TMV gs vänligen av Dr. Michael Laue från det Robert Koch Institutet. HPIEN avbildar gs vänligen av Dr. Patrick Frederix, Universitetar av Basel.

Källa: JPK Instrumenterar

För mer information på denna källa behaga besök JPK Instrumenterar

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:30

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit