于学习微生物完全适合的 NanoWizard bioAFM 由 JPK 仪器

包括的事宜

简介
微生物学的纳米技术
酵母
细菌
病毒
结论
鸣谢

简介

术语 “微生物学”一般描述那些有机体的研究无形对肉眼,特别是酵母、细菌和病毒。 然而,有机体的这三种类型从彼此是较大不同。 酵母和细菌分别为不同的细胞类型 (真核状态和初核质),而病毒不严格是一个生存有机体,是强制细胞内寄生生物。 开展研究的工具在微生物学方面可以分隔到二个主要域显微学,对于形象化是必需的,并且分子生物学,用于分析 (在某些情况下全面) 基因和 proteomic 组成这些有机体。

微生物学的纳米技术

在随着第一个显微镜的出现,开张微生物学的域的初始步骤来。 使用一个简单,自制造的显微镜,细菌由安东尼 van Leeuwenhoek 首先形象化,大约 1676。 Leeuwenhoek 编译的显微镜不是复合显微镜,依靠一唯一 lense,更多象一个非常强大的放大镜。 他的一个细菌的第一个说明 (指微动物) 是从从 van Leeuwenhoek 的齿刮的范例。

当酵母用于发酵和发酵面包大约 5000 年时,在 1860年是路易斯・巴斯德首先描述了酵母, Saccharomyces Cerevisiae 作为这些进程 effecter。 路易斯・巴斯德由 S. 的说明多年来做对微生物学的域的许多重大摊缴,啤酒,对他典雅的实验反驳无生源说和他的根本作用的原理在疾病和早期的疫苗研制的微生物理论上。 实际上,其中一 Pasteur 的成功在疫苗研制领域是变稀狂犬病病毒通过射入的热化作为疫苗,尽管能形象化在受影响的组织的病毒。

在光学显微学做的推进由厄恩斯特神父和卡尔 19 世纪 80 年代的蔡司联合的工作进一步扩大了这个微生物学的世界的研究。 然而,被描述的神父,有限额对光学显微学的解决方法,从属于照亮光和透镜的数值口径的波长。 实际上,光学显微学的解决方法被限制到一半光波长或者大约 250 毫微米。 同样地,在 1931年在 1935年病毒结构的研究必须由厄恩斯特 Ruska 和随后的结晶等待电子显微镜的出现烟草斑纹病毒由 Wendall 斯坦利。

最近,基本强制显微镜开张了结构的调查和处理的一个新的路径在一个非常小规模的。 其中一个 AFM 的经常被援引的好处在生物结构的研究中是这个情况,不同于电子显微镜术,高分辨率图象可以在生理情况下得到。 然而,比其高分辨率想象的能力有更多对 AFM。 AFM 的机械本质在 piconewton 范围意味着悬臂,用于想象,可能也用于评定交往强制。

同样地,不仅能 AFM 图象微生物表面在高分辨率,在生理情况下,它可能也使用调查在微生物和目标表面之间的约束力。

JPK Nanowizard® BioAFM 完全配合与这样研究。 Nanowizard® 在一个被倒置的光学显微镜被设计同时与光学显微学一起使用和被安装,允许信息多频道是收集和减少实验时间通过允许用户在浏览与 AFM 的一个特殊区域前光学上识别细胞的地点利益。 特殊地被设计的范例持有人, JPK BioCell™,实现实验在 15-60°C 在稀薄的玻璃盖玻片,这样之间的温度光学图象的质量在没减少的。 另外, JPK Nanowizard® 陈列优越稳定性,允许细胞要素高分辨率想象,例如细菌表层 (图 1) 以及生理想象全部的细胞,从原核生物到真核。

图 1. 从 Deinococcus radiodurans 的 HPI 层,帕特里克 Frederix,巴塞尔大学博士亲切地提供的图象。

酵母

酵母 S. cerevisae,也已知作为发芽的酵母,有用不仅在从做面包的工业生产方法中到酿造啤酒,它也是一个类型有机体在真核状态的细胞的研究中。 因为啤酒的 S. 有能力在单倍体或二倍体增长上并且是与两三时数的一个双工资的单细胞有机体,它证明非常合适对基本发挥作用的研究真核状态的细胞。

啤酒的酵母 S. 由细胞壁包围组成由蛋白质、多聚糖和少量甲壳质。 电子显微镜术向显示此细胞壁是浓厚排列一个的层型结构 300 毫微米。 这块内在层借机械力量和由 â1,2-glycan 和甲壳质组成。 这块外面层在细胞之间的识别活动介入和由大量地葡基化的 mannoproteins 主要组成。 碳水化合物侧链的出现在这些 mannoproteins 的使细胞壁亲水并且导致多个负电荷在生理 PH。 当印象与 AFM,这个细胞的表面看上去非常平稳和容易地被扭屈,需要在最小的强制 (图 2) 的仔细扫描。 唯一的明显的表面功能是芽伤痕在母细胞的对面对最近形成的子细胞。 表面看上去平稳作为糖遮暗膜。

图 2. 啤酒 S. 的想象。 酵母细胞使用 DIC 显微学 (a) 然后印象位于在流体的联系模式与 AFM (b)。 在 (c) 从高度通道生成的 3D 图象被显示,显示在母细胞 (黄色箭头的芽伤痕。)

其中一个 AFM 的唯一功能源于显微镜的机械本质。 灵活的悬臂可以被校准和随后用于计算交往强制。 这可能然后用于确定交往强制范例和悬臂之间的和的长度曲面元将舒展,在悬臂的连结被爆裂前。

这里,我们带领了悬臂进入与一定数量的点的联络在这个母亲和子细胞表面。 至少 10 强制距离曲线获得了在每个细胞的多点。

从强制距离曲线,多种数据可以被提取。 在表 3,仅一个延伸曲线 (作为悬臂处理表面并且扭屈) 在红色被密谋了。 其他弯曲全部对应于悬臂的折回或者收缩远离表面的。 在此收缩阶段期间,如果曲面元一定到悬臂,悬臂向下将偏转作为压力移动拿着远离表面的这个筹码悬臂。 因为悬臂向下偏转强制被应用于曲面元附加悬臂将增加。 在原生质和悬臂之间的债券是残破的强制,悬臂将攫取回到其非偏转的位置。

图 3. 交往的强制距离曲线悬臂和女儿 (a) 或母细胞之间 (b) 的表面的。 在红色是延伸曲线,其他是缩回曲线。 最大的断开的强制 (f) 和分隔距离 (d) 可以从此数据被计算。 蓝色箭头指示是预示的有弹性舒展分子曲线的区域。

强制距离曲线的缩回部分的形状可能也指示某事关于附上原生质的有形资产。 在这种情况下曲线的形状向显示曲面元附加悬臂扭屈有弹性,在与悬臂的交往是残破的前。 另外,从此请折回曲线一能确定要求的强制中断债券和距离分隔从此政券中断发生的表面。

有在同一个细胞获得的强制距离曲线之间的可变性,由于这样的事实没有悬臂和细胞表面之间的每交往导致原生质的附件到悬臂,悬臂永远不会附有分子的末端,并且表面构成是固有地异种的。 获取强制距离曲线的一个满足的编号因此是重要的,以便数据可能有效从属于到统计分析。 这里, 100 强制曲线在每个细胞被评定了,并且最大的断开的强制、 F 和分隔距离在破裂, D,在表 4 被计算了和存在作为直方图。 当检测了,值 F 和 D 只被计算了一个表面分子和悬臂之间的交往。

图 4. 扩展名直方图疏远 D (a) 和最大的断开的强制母亲和子细胞的 F (b)。

一旦距离到破裂,值直方图向显示为两个细胞数据通常被分配 400 毫微米 (图 4A),然后为两个细胞有一些更大的外围之物。 为了比较二数据集在 400 毫微米上的外围之物忽视。 在这些约束内,母细胞的 D = 139 ± 56 毫微米和子细胞的 D = 86 ± 43 毫微米。 确定这些值是较大不同,使用一个两侧的学员 T 测试。

数据为最大的断开的强制向显示,平均,母细胞的断开的强制高于那子细胞 (母亲, F = 352 pN : 女儿, F = 167 pN)。 然而,在这种情况下,有断开的强制的一个更加清楚的配电器,并且在两种情况下,有没有悬臂的偏折的一定数量的强制距离曲线,即表面分子没有捆绑到悬臂 (图 4B)。 这些数据建议在细胞壁的结构和构成上的一个区别在这个母亲和子细胞之间的。

细菌

因为 AFM 是表面成象技术,它用于分析表面结构在高分辨率。 有些细菌陈列一个屠宰者或者表层,包括蛋白质一个有规律地被包装的格子。 这个装箱借结构稳定度对这个范例,如此查出的,水晶屠宰者可以是印象的在高分辨率,陈列各自的蛋白质亚单位。 从太古细菌 Deinococcus radiodurans 的六角被包装的中间层 (图 1) 是一个著名的示例。 在此 HPI 层的 AFM 图象,而其他是闭合的,一个能看到各自的亚单位每个毛孔,和其中一些毛孔在开放相应一致。

当多数太古细菌展览屠宰者,真菌实验室张力一般不时。 最常用的实验室细菌是 Eschericia 杆菌,革兰氏阴性的细菌。 革兰氏阴性的细菌有一个质膜,包围由的一个 periplasmic 空间有严格,但是高度多孔细胞壁 peptidoglycan。 这由一个外面膜然后包围,变化的长度 lipopolysaccarides 延伸。

图 5. DH5a 细胞断断续续的联系模式图象。 概览高度 (a) 和错误发信号 (b) 图象和细菌的表面的一个更高的放大错误信号图象 (c)。

这里,我们有大肠埃希氏菌、 DH5a 和 OP50 印象的二张力。 DH5a 的图象显示经典之作,许多革兰氏阴性的细菌标尺形状。 细胞在航空 (在缓冲 (图 6) 的图 5) 浏览和。 当印象在航空,细菌的表面看上去高度仿造。 另外,在细菌附近的一个光晕是明显的。 这些结构可能对应于 pili,被找到在大肠埃希氏菌表面。 相反,当印象在流体 (图 6) 细菌的表面看上去更加平稳。 在这种情况下这归结于这个情况在扫描期间,表面结构将由这个技巧的移动容易地偏移,因为他们到位没有被修理。

图 6. DH5a 断断续续的联系模式图象在流体的。 从地形学数据生成的 3D 图象 (a) 和一个更高的放大错误信号图象 (b) 被显示。

OP50 张力,虽然同样大肠埃希氏菌,看上去相当不同。 OP50 原来地查出作为可能用于提供 Caenorhabditis elegans 的张力。 它是要求小于其他大肠埃希氏菌张力的更加脆弱和的张力环丙烯醯。 当印象在航空 (图 7) 这些细菌不陈列构建的表面和被看见一样为 DH5a。 另外,细胞是更加脆弱的,并且一定是仔细印象的避免去除他们从表面。 在流体,表面比那也构建 DH5a,并且细胞表面的地区在扫描方向被偏移,可能与糖和其他灵活的结构的位移相应在这个细胞的表面。

图 7. OP50 细菌图象印象在航空 (地势, Berror 信号) 和流体 (C- 地势, D- 错误信号)。

悬臂可能也用于探查交往用糖在细菌的表面 (如显示为 S. 啤酒上述)。 然而,这里我们附有了细菌悬臂 (使用多 L 赖氨酸) 并且评定了细菌和云母表面 (图 8) 之间的交往。 这样技术是唯一的因为它允许细菌表面交往的量化,重要为 biofouling 的研究在工业生产方法中。 使用 JPK Biocell™作为范例持有人允许化合物的在原处添加阻拦这些交往。

图 8. 有代表性的交往的强制距离 curvers 悬臂式 DH5a 和云母表面之间的,在缓冲。 延伸曲线在红色存在,所有蓝色曲线是收缩曲线。 增加应用的强制没有增加最大的断开的强制。 箭头指示各自的断开的活动。

与悬臂的交往比较有 S. 啤酒表面的, DH5á 云母交往有代表性的强制距离曲线在表 8. 存在,那里是没有这个范例的弹性变形。 一定数量的分离断开的活动能被看到,可能与断开各自的曲面元相应。 再次,从强制距离曲线一能定量要求的最大强制从表面分隔细菌,然而一个可能也开始调查各自的断开的活动。

病毒

病毒是强制细胞内寄生生物包括脱氧核糖核酸或核糖核酸的组成由外面蛋白质外套周围的基因。 此基因不包含对于副本是必需的所有信息,反而病毒需要推翻寄主细胞的蜂窝电话机械繁殖。 病毒是非常小的,大约 20 毫微米到 400 毫微米。 这意味着病毒结构的描述特性要求高分辨率成象技术,例如基本强制显微学。 这里我们有印象的烟草斑纹病毒 (TMV),第一病毒印象使用电子显微镜术。

图 9. TMV 微粒断断续续的联系模式图象。 存在地势 (a),阶段 (b) 和错误同一个范例区域的信号图象 (c)。

TMV 微粒被吸附了对云母和印象使用断断续续的联系模式。 这些病毒微粒叫作螺线 capsids,在一个螺线模式的外套蛋白质栈在基因附近。 此螺线堆积在高度、阶段和错误信号通道 (图 9) 能被看到。 使用 BioAFM 的一个重大的好处,例如对图象生物范例的 JPK Nanowizard®,是想象在流体可以执行。 同样地,病毒微粒可以是印象的在他们的靶细胞表面,在流体。 这里,我们有印象的流感病毒附有红血球表面,在流体,使用断断续续的联系模式。 病毒微粒明显地是印象的在细胞的表面。

图 10. 流感病毒微粒与红血球的表面相关。 概览图象 (a) 和红血球表面的更高的放大图象 (b) 显示流感病毒微粒 (空白箭头)

结论

Nanowizard® bioAFM 完全适用与微生物的研究。 JPK Biocell 提供生理情况,无需牺牲 AFM 稳定性或光学质量。 显微镜的稳定性启用各自的蛋白质亚单位想象,并且充分的综合化到一个被倒置的光学显微镜里使显微学技术的组合同时执行。 不仅此平台允许微生物范例的高分辨率图象,它可以用于定量交往强制在有机体和表面之间或者在悬臂式和表面关联分子之间。

鸣谢

对杰费 Stear,最大 Planck 学院博士的多谢分子细胞生物学和遗传学,大肠埃希氏菌和 S. 啤酒范例。 TMV 由迈克尔 Laue 博士从罗伯特 Koch 学院的亲切地提供。 HPI 图象由帕特里克 Frederix,巴塞尔大学博士亲切地提供。

来源: JPK 仪器

关于此来源的更多信息请参观 JPK 仪器

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:46

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