於學習微生物完全適合的 NanoWizard bioAFM 由 JPK 儀器

包括的事宜

簡介
微生物學的納米技術
酵母
細菌
病毒
結論
鳴謝

簡介

術語 「微生物學」一般描述那些有機體的研究無形對肉眼,特別是酵母、細菌和病毒。 然而,有機體的這三種類型從彼此是較大不同。 酵母和細菌分別為不同的細胞類型 (真核狀態和初核質),而病毒不嚴格是一個生存有機體,是強制細胞內寄生生物。 開展研究的工具在微生物學方面可以分隔到二個主要域顯微學,對於形象化是必需的,并且分子生物學,用於分析 (在某些情況下全面) 基因和 proteomic 組成這些有機體。

微生物學的納米技術

在隨著第一個顯微鏡的出現,開張微生物學的域的初始步驟來。 使用一個簡單,自製造的顯微鏡,細菌由安東尼 van Leeuwenhoek 首先形象化,大約 1676。 Leeuwenhoek 編譯的顯微鏡不是複合顯微鏡,依靠一唯一 lense,更多像一個非常強大的放大鏡。 他的一個細菌的第一個說明 (指微動物) 是從從 van Leeuwenhoek 的齒刮的範例。

當酵母用於發酵和發酵麵包大約 5000 年時,在 1860年是路易斯・巴斯德首先描述了酵母, Saccharomyces Cerevisiae 作為這些進程 effecter。 路易斯・巴斯德由 S. 的說明多年來做對微生物學的域的許多重大攤繳,啤酒,對他典雅的實驗反駁無生源說和他的根本作用的原理在疾病和早期的疫苗研製的微生物理論上。 實際上,其中一 Pasteur 的成功在疫苗研製領域是變稀狂犬病病毒通過射入的熱化作為疫苗,儘管能形象化在受影響的組織的病毒。

在光學顯微學做的推進由厄恩斯特神父和卡爾 19 世紀 80 年代的蔡司聯合的工作進一步擴大了這個微生物學的世界的研究。 然而,被描述的神父,有限額對光學顯微學的解決方法,從屬於照亮光和透鏡的數值口徑的波長。 實際上,光學顯微學的解決方法被限制到一半光波長或者大約 250 毫微米。 同樣地,在 1931年在 1935年病毒結構的研究必須由厄恩斯特 Ruska 和隨後的結晶等待電子顯微鏡的出現煙草斑紋病毒由 Wendall 斯坦利。

最近,基本強制顯微鏡開張了結構的調查和處理的一個新的路徑在一個非常小規模的。 其中一個 AFM 的經常被援引的好處在生物結構的研究中是這個情況,不同於電子顯微鏡術,高分辨率圖像可以在生理情況下得到。 然而,比其高分辨率想像的能力有更多對 AFM。 AFM 的機械本質在 piconewton 範圍意味著懸臂,用於想像,可能也用於評定交往強制。

同樣地,不僅能 AFM 圖像微生物表面在高分辨率,在生理情況下,它可能也使用調查在微生物和目標表面之間的約束力。

JPK Nanowizard® BioAFM 完全配合與這樣研究。 Nanowizard® 在一個被倒置的光學顯微鏡被設計同時與光學顯微學一起使用和被安裝,允許信息多頻道是收集和減少實驗時間通過允許用戶在瀏覽與 AFM 的一個特殊區域前光學上識別細胞的地點利益。 特殊地被設計的範例持有人, JPK BioCell™,實現實驗在 15-60°C 在稀薄的玻璃蓋玻片,這樣之間的溫度光學圖像的質量在沒減少的。 另外, JPK Nanowizard® 陳列優越穩定性,允許細胞要素高分辨率想像,例如細菌表層 (圖 1) 以及生理想像全部的細胞,從原核生物到真核。

圖 1. 從 Deinococcus radiodurans 的 HPI 層,帕特里克 Frederix,巴塞爾大學博士親切地提供的圖像。

酵母

酵母 S. cerevisae,也已知作為發芽的酵母,有用不僅在從做麵包的工業生產方法中到釀造啤酒,它也是一個類型有機體在真核狀態的細胞的研究中。 因為啤酒的 S. 有能力在單倍體或二倍體增長上并且是與兩三時數的一個雙工資的單細胞有機體,它證明非常合適對基本發揮作用的研究真核狀態的細胞。

啤酒的酵母 S. 由細胞壁包圍組成由蛋白質、多聚糖和少量甲殼質。 電子顯微鏡術向顯示此細胞壁是濃厚排列一個的層型結構 300 毫微米。 這塊內在層借機械力量和由 â1,2-glycan 和甲殼質組成。 這塊外面層在細胞之間的識別活動介入和由大量地葡基化的 mannoproteins 主要組成。 碳水化合物側鏈的出現在這些 mannoproteins 的使細胞壁親水并且導致多個負電荷在生理 PH。 當印象與 AFM,這個細胞的表面看上去非常平穩和容易地被扭屈,需要在最小的強制 (圖 2) 的仔細掃描。 唯一的明顯的表面功能是芽傷痕在母細胞的對面對最近形成的子細胞。 表面看上去平穩作為糖遮暗膜。

圖 2. 啤酒 S. 的想像。 酵母細胞使用 DIC 顯微學 (a) 然後印象位於在流體的聯繫模式與 AFM (b)。 在 (c) 從高度通道生成的 3D 圖像被顯示,顯示在母細胞 (黃色箭頭的芽傷痕。)

其中一個 AFM 的唯一功能源於顯微鏡的機械本質。 靈活的懸臂可以被校準和隨後用於計算交往強制。 這可能然後用於確定交往強制範例和懸臂之間的和的長度麴面元將舒展,在懸臂的連結被爆裂前。

這裡,我們帶領了懸臂進入與一定數量的點的聯絡在這個母親和子細胞表面。 至少 10 強制距離曲線獲得了在每個細胞的多點。

從強制距離曲線,多種數據可以被提取。 在表 3,仅一个延伸曲線 (作為懸臂處理表面并且扭屈) 在紅色被密謀了。 其他彎曲全部對應於懸臂的折回或者收縮遠離表面的。 在此收縮階段期間,如果麴面元一定到懸臂,懸臂向下將偏轉作為壓力移動拿著遠離表面的這個籌碼懸臂。 因為懸臂向下偏轉強制被應用於麴面元附加懸臂將增加。 在原生質和懸臂之間的債券是殘破的強制,懸臂將攫取回到其非偏轉的位置。

圖 3. 交往的強制距離曲線懸臂和女兒 (a) 或母細胞之間 (b) 的表面的。 在紅色是延伸曲線,其他是縮回曲線。 最大的斷開的強制 (f) 和分隔距離 (d) 可以從此數據被計算。 藍色箭頭指示是預示的有彈性舒展分子曲線的區域。

強制距離曲線的縮回部分的形狀可能也指示某事關於附上原生質的有形資產。 在這種情況下曲線的形狀向顯示麴面元附加懸臂扭屈有彈性,在與懸臂的交往是殘破的前。 另外,從此请折回曲線一能確定要求的強制中斷債券和距離分隔從此政券中斷發生的表面。

有在同一個細胞獲得的強制距離曲線之間的可變性,由於這樣的事實沒有懸臂和細胞表面之間的每交往導致原生質的附件到懸臂,懸臂永遠不會附有分子的末端,并且表面構成是固有地異種的。 獲取強制距離曲線的一個滿足的編號因此是重要的,以便數據可能有效從屬於到統計分析。 這裡, 100 強制曲線在每個細胞被評定了,并且最大的斷開的強制、 F 和分隔距離在破裂, D,在表 4 被計算了和存在作為直方圖。 當檢測了,值 F 和 D 只被計算了一個表面分子和懸臂之間的交往。

圖 4. 擴展名直方圖疏遠 D (a) 和最大的斷開的強制母親和子細胞的 F (b)。

一旦距離到破裂,值直方圖向顯示為兩個細胞數據通常被分配 400 毫微米 (圖 4A),然後為兩個細胞有一些更大的外圍之物。 為了比較二數據集在 400 毫微米上的外圍之物忽視。 在這些約束內,母細胞的 D = 139 ± 56 毫微米和子細胞的 D = 86 ± 43 毫微米。 確定這些值是較大不同,使用一個兩側的學員 T 測試。

數據為最大的斷開的強制向顯示,平均,母細胞的斷開的強制高於那子細胞 (母親, F = 352 pN : 女兒, F = 167 pN)。 然而,在這種情況下,有斷開的強制的一個更加清楚的配電器,并且在兩種情況下,有沒有懸臂的偏折的一定數量的強制距離曲線,即表面分子沒有捆綁到懸臂 (圖 4B)。 這些數據建議在細胞壁的結構和構成上的一個區別在這個母親和子細胞之間的。

細菌

因為 AFM 是表面成像技術,它用於分析表面結構在高分辨率。 有些細菌陳列一個屠宰者或者表層,包括蛋白質一個有規律地被包裝的格子。 這個裝箱借結構穩定度對這個範例,如此查出的,水晶屠宰者可以是印象的在高分辨率,陳列各自的蛋白質亞單位。 從太古細菌 Deinococcus radiodurans 的六角被包裝的中間層 (圖 1) 是一個著名的示例。 在此 HPI 層的 AFM 圖像,而其他是閉合的,一个能看到各自的亞單位每個毛孔,和其中一些毛孔在開放相應一致。

當多數太古細菌展覽屠宰者,真菌實驗室張力一般不時。 最常用的實驗室細菌是 Eschericia 桿菌,革蘭氏陰性的細菌。 革蘭氏陰性的細菌有一個質膜,包圍由的一個 periplasmic 空間有嚴格,但是高度多孔細胞壁 peptidoglycan。 這由一個外面膜然後包圍,變化的長度 lipopolysaccarides 延伸。

圖 5. DH5a 細胞斷斷續續的聯繫模式圖像。 概覽高度 (a) 和錯誤發信號 (b) 圖像和細菌的表面的一個更高的放大錯誤信號圖像 (c)。

這裡,我們有大腸埃希氏菌、 DH5a 和 OP50 印象的二張力。 DH5a 的圖像顯示經典之作,許多革蘭氏陰性的細菌標尺形狀。 細胞在航空 (在緩衝 (圖 6) 的圖 5) 瀏覽和。 當印象在航空,細菌的表面看上去高度仿造。 另外,在細菌附近的一個光暈是明顯的。 這些結構可能對應於 pili,被找到在大腸埃希氏菌表面。 相反,當印象在流體 (圖 6) 細菌的表面看上去更加平穩。 在這種情況下這歸結於這個情況在掃描期間,表面結構將由這個技巧的移動容易地偏移,因為他們到位沒有被修理。

圖 6. DH5a 斷斷續續的聯繫模式圖像在流體的。 從地形學數據生成的 3D 圖像 (a) 和一個更高的放大錯誤信號圖像 (b) 被顯示。

OP50 張力,雖然同樣大腸埃希氏菌,看上去相當不同。 OP50 原來地查出作為可能用於提供 Caenorhabditis elegans 的張力。 它是要求小於其他大腸埃希氏菌張力的更加脆弱和的張力環丙烯醯。 當印象在航空 (圖 7) 這些細菌不陳列構建的表面和被看見一樣為 DH5a。 另外,細胞是更加脆弱的,并且一定是仔細印象的避免去除他們從表面。 在流體,表面比那也構建 DH5a,并且細胞表面的地區在掃描方向被偏移,可能與糖和其他靈活的結構的位移相應在這個細胞的表面。

圖 7. OP50 細菌圖像印象在航空 (地勢, Berror 信號) 和流體 (C- 地勢, D- 錯誤信號)。

懸臂可能也用於探查交往用糖在細菌的表面 (如顯示為 S. 啤酒上述)。 然而,這裡我們附有了細菌懸臂 (使用多 L 賴氨酸) 并且評定了細菌和雲母表面 (圖 8) 之間的交往。 這樣技術是唯一的因為它允許細菌表面交往的量化,重要為 biofouling 的研究在工業生產方法中。 使用 JPK Biocell™作為範例持有人允許化合物的在原處添加阻攔這些交往。

圖 8. 有代表性的交往的強制距離 curvers 懸臂式 DH5a 和雲母表面之間的,在緩衝。 延伸曲線在紅色存在,所有藍色曲線是收縮曲線。 增加應用的強制沒有增加最大的斷開的強制。 箭頭指示各自的斷開的活動。

與懸臂的交往比較有 S. 啤酒表面的, DH5á 雲母交往有代表性的強制距離曲線在表 8. 存在,那裡是沒有這個範例的彈性變形。 一定數量的分離斷開的活動能被看到,可能與斷開各自的麴面元相應。 再次,從強制距離曲線一能定量要求的最大強制從表面分隔細菌,然而一个可能也開始調查各自的斷開的活動。

病毒

病毒是強制細胞內寄生生物包括脫氧核糖核酸或核糖核酸的組成由外面蛋白質外套周圍的基因。 此基因不包含對於副本是必需的所有信息,反而病毒需要推翻寄主細胞的蜂窩電話機械繁殖。 病毒是非常小的,大約 20 毫微米到 400 毫微米。 這意味著病毒結構的描述特性要求高分辨率成像技術,例如基本強制顯微學。 這裡我們有印象的煙草斑紋病毒 (TMV),第一病毒印象使用電子顯微鏡術。

圖 9. TMV 微粒斷斷續續的聯繫模式圖像。 存在地勢 (a),階段 (b) 和錯誤同一個範例區域的信號圖像 (c)。

TMV 微粒被吸附了對雲母和印象使用斷斷續續的聯繫模式。 這些病毒微粒叫作螺線 capsids,在一個螺線模式的外套蛋白質棧在基因附近。 此螺線堆積在高度、階段和錯誤信號通道 (圖 9) 能被看到。 使用 BioAFM 的一個重大的好處,例如對圖像生物範例的 JPK Nanowizard®,是想像在流體可以執行。 同樣地,病毒微粒可以是印象的在他們的靶細胞表面,在流體。 這裡,我們有印象的流感病毒附有紅血球表面,在流體,使用斷斷續續的聯繫模式。 病毒微粒明顯地是印象的在細胞的表面。

圖 10. 流感病毒微粒與紅血球的表面相關。 概覽圖像 (a) 和紅血球表面的更高的放大圖像 (b) 顯示流感病毒微粒 (空白箭頭)

結論

Nanowizard® bioAFM 完全適用與微生物的研究。 JPK Biocell 提供生理情況,无需犧牲 AFM 穩定性或光學質量。 顯微鏡的穩定性啟用各自的蛋白質亞單位想像,并且充分的綜合化到一個被倒置的光學顯微鏡裡使顯微學技術的組合同時執行。 不僅此平臺允許微生物範例的高分辨率圖像,它可以用於定量交往強制在有機體和表面之間或者在懸臂式和表面關聯分子之間。

鳴謝

對傑費 Stear,最大 Planck 學院博士的多謝分子細胞生物學和遺傳學,大腸埃希氏菌和 S. 啤酒範例。 TMV 由邁克爾 Laue 博士從羅伯特 Koch 學院的親切地提供。 HPI 圖像由帕特里克 Frederix,巴塞爾大學博士親切地提供。

來源: JPK 儀器

關於此來源的更多信息请請參觀 JPK 儀器

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:49

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