Studieren der Interaktion Zwischen Dopamin und D1-Receptor in SH-SY5Y Zellen unter Verwendung der AtomKraft-Mikroskopie

Themen Umfaßt

Einleitung
Probenaufbereitung
Unter Verwendung FLUGHANDBUCHS, zum des Dopamins Aufzuspüren, das zu den Membrangebundenen Empfängern D1 Binging ist
Ergebnisse
Schlussfolgerung

Einleitung

Zusätzlich zu seinen Darstellungsfähigkeiten der hohen Auflösung ist Atomkraft (AFM)mikroskopie als leistungsfähiges Hilfsmittel für das Messen der nanomechanical Eigenschaften und der Interaktionskräfte von biomolekularen Komplexen aufgetaucht. Während die Mehrheit dieser Baumuster von FLUGHANDBUCH-Studien auf getrennte Moleküle, denn wahre biologische Bedeutung geleitet worden sind, sollten diese Untersuchungen auf Livezellanlagen ideal durchgeführt werden.

Darüber hinaus sieht es jetzt wesentlich aus, in der Lage zu sein, FLUGHANDBUCH mit anderen Techniken wie optischer Mikroskopie zu verbinden, um beide Baumuster Daten gleichzeitig zu montieren. Bis jetzt sehr basieren wenige Studien auf der Kombination von FLUGHANDBUCH und von umgekehrter optischer Mikroskopie.

In der vorliegenden Untersuchung forschten wir die mögliche Anwendung von Kraftmessungen nach, wenn wir die Antwort und die Bindefähigkeiten des Empfängers des Dopamins D1 nach Stimulierung mit Dopamin überwachten. Wir verwendeten eine völlig integrierte FLUGHANDBUCH- und epifluorescenceanlage, um Fluoreszenzdarstellung und FLUGHANDBUCH-Kraftmessungen aufeinander zu beziehen.

Dopamin (DA, 4 (2-aminoethyl) benzene-1,2-diol) ist ein bedeutender Neurotransmitter, der der Benzkatechinaminfamilie gehört, basiert auf einer aromatischen Aminosäure, die Tyrosin genannt wird und ist der Vorläufer von zwei Haupthormonen: Adrenalin und noradrenalin.

Im Zusatznervensystem ist die Hauptrolle des Dopamins, kardiovaskuläre Funktionen als Analeptic, Hormonumsatz, Nierenfunktion, Gefäßfluß und gastro-intestinale Motilität zu modulieren. Im Zentralnervensystem (CNS) wird Dopamin in die Regelung der lokomotorischen Funktions-, Erkennen-, Gefühl-, Nahrungsaufnahme- und Drüsenregelung miteinbezogen. Funktionsstörung der dopaminergischen Neurotransmission im CNS wird mit einer Vielzahl von neuropsychiatrischen Störungen, einschließlich Tourettes Syndrom, Parkinson-Krankheit, Schizophrenie, Paranoia und Aufmerksamkeitsdefizit Hyperaktivitätsstörung (ADHD) verbunden. Dopaminempfänger werden von D1 zu D5 tarifiert, von dem Empfänger D1 und D2 den größten Anteil bilden. Für Behandlung dieser Krankheiten ist das Kennzeichen von den dopaminergischen Drogen, die von den Nebenwirkungen leer sind, eine der größten Herausforderungen in der neuronalen Forschung und in der Drogenentdeckung.

In dieser bestimmten Studie verwendeten wir einen YFP-beschrifteten Empfänger des Transmembrane D1, um die specifi Stadt der Interaktion zwischen diesem Empfänger und einer Dopamin-modifi Ed FLUGHANDBUCH-Spitze, unter Verwendung der Kraftspektroskopie und der optischen Darstellungsmerkmale unseres integrierten Hilfsmittels nachzuforschen.

Probenaufbereitung

SH-SY5Y Zellen transfected mit dem YFP-mit Warnschild versehenen Empfänger des Dopamins D1 (DRD1-EYFP). Transfection wurde durch nucleofection (Nucelofector, AMAXA) unter Verwendung einer Zellsuspension (10 cells/ml6 ), 4 µg Plasmide DNS und des 100 µl Transfectionsbuffers (AMAXA) durchgeführt. Nachfolgend wurden Zellen auf sterilen Abdeckungsbelegen (18x18 mm) in 6 wohlen Platten gesät. 48 h nach den anhaftenden Zellen des Transfection, die das DRD1-EYFP ausdrücken, wurden mit µM 10-50 Dopaminhydrochlorid angeregt.

Bilder (BF) Brightfield, DIC und des epifluorescence wurden auf einem umgekehrten Mikroskop Beobachters Zeiss Axio erworben, das mit einer Kamera AxioCam MRC und der AxioVisions-Software ausgerüstet wurde. Alle FLUGHANDBUCH-Bilder wurden auf einem FLUGHANDBUCH, das völlig mit dem optischen Mikroskop integriert worden ist, unter Verwendung DNP-/MSCTkragbalken aufgezeichnet.

Alle Experimente wurden im Kontakt und in TappingMode™ unter Verwendung PBS-Buffers und der weichsten DNP- und MSCT-artigen Kragbalken durchgeführt (nominale Federkonstante 0,06 N/m und 0.01N/m, beziehungsweise.). Dopaminefunctionalized-Kragbalken wurden vorbereitet, wie vorher beschrieben.

Kurz wurde ein (PEG) Polyäthylenglykolderivat, ein Amino-reagierendes Ende und ein Thiolalkohol-reagierendes Ende habend, als Verknüpfungsprogramm und als träges lling Molekül ZurückfI verwendet, damit nur Dopamin zu den beobachteten verbindlichen Interaktionen beitragen konnte. Federkonstanten wurden in der Flüssigkeit auf einer steifen Halterung (Glasunterseite der Petrischale) berechnet und Ausschlagempfindlichkeit wurden manuell in der Software aktualisiert. Insgesamt Kurven mit 3072 Kräften wurden im Kraftvolumenmodus, mit Scan-Kinetik zwischen 3 und 3,5 Hz und mit einer Einfahrungsverzögerung von Frau 10 aufgezeichnet. Der Scan-Bereich war µm 2x2.

Unter Verwendung FLUGHANDBUCHS, zum des Dopamins Aufzuspüren, das zu den Membrangebundenen Empfängern D1 Binging ist

Die overexpressed YFP-mit Warnschild versehenen Empfänger D1 lokalisieren hauptsächlich in der Plasmamembran und zeigen eine gelegentliche Verteilung in neuronalen SH-SY5Y Zellen. Basiert auf Fluoreszenzdaten internalisieren die Empfänger in den Zytoplasma nach Stimulierung mit Dopamin. Um diese Hypothese zu unterstützen und die mögliche Anwendung von FLUGHANDBUCH zu prüfen, spürten wir Schwergängigkeit von DA zu den membrangebundenen Empfängern D1 und zu ihrer nachfolgenden Internalisierung auf.

Zuerst functionalized DNP-Kragbalken mit einer Dopaminentsprechung, wie in Abbildung 1. dargestellt. Im nächsten Schritt Livewurden die zellen einigen DA-Konzentrationen von 10 bis µM 50 ausgesetzt, um die Empfänger der Membran anzuregen D1.

Abbildung 1. Studierende Ligandempfänger Interaktionen auf einer lebenden Zelle. Die FLUGHANDBUCH-Spitze functionalized, sodass die chemischen Hälften des Dopamins (DA) mit einbezogen in die Interaktion in sein D1-receptor konserviert werden. Darüber hinaus setzt die Länge des Distanzstückes den Effekt der Spitze auf die Interaktion selbst herab.

Wurden epifluorescence Bilder und timelapse Filme aufgezeichnet, um Änderungen im Leuchtstoffsignal der Verteilung des Empfängers zu entdecken D1 und infolgedessen, die Internalisierung und die Bindefähigkeiten des YFP-mit Warnschild versehenen Dopamins D1-receptor nachzuforschen.

Abbildung 2A zeigt das Experiment an t0: diesmal Punkt ist das Dopamin nicht aufgetragen worden und folglich, werden Empfänger D1 nicht angeregt. Infolgedessen bleiben die YFP-mit Warnschild versehenen Empfänger D1 membrangebunden, ein homogenes Leuchtstoffbeflecken über der Zelloberfläche aufdeckend. Eine bedeutende Änderung in der Leuchtstoffverteilung wird nach Stimulierung des D1-receptor von DA erzielt. Abbildung 2B zeigt ein typisches Beispiel der Bilder, die an T. aufgezeichnet werden.10min Für alle DA-Konzentrationen wurde kein Membranflorida-uorescence nach einer 10-Minute-Ausbrütung entdeckt.

Abbildung 2. Übereinstimmungsfluoreszenzdarstellung und FLUGHANDBUCH-Kraftmessungen. Die FLUGHANDBUCH-Spitze wurde mit einer DA-Entsprechung mit Warnschild versehen, um dem Einbauort YFP-mit Warnschild versehenen D1-receptors vor und nach dem Anwenden von freiem DA zu folgen. Vor Stimulierung durch DA, sind Empfänger die membrangebundene Zelle und folglich, wird Fluoreszenz ganz über die Zelloberfläche (a) verteilt und Kraftkurven weisen einen hohen Prozentsatz von spezifischen befreienden Ereignissen (c) auf. 10 Minuten nach DA-Anwendung, wird die ganze Fluoreszenz in kleine Punkte (b) konzentriert und keine specifi c Ereignisse werden im Kraftvolumen aufgezeichnet, das prüft, dass alle Empfänger in den Cytosol internalisiert worden sind.

Stattdessen wurden mehrfache kleine intrazelluläre Leuchtstoffbäschenvariable an Größe und Helligkeit beobachtet, mögliche Empfängerinternalisierung anzuzeigen (Abbildung 2B). Diese Beobachtungsstellen zu einer aktiven Schwergängigkeit des Ligand DA zum Empfänger D1 in der SH-SY5Y Zelle formen. Beachten Sie, dass schwache Fluoreszenz erforderlich uns signalisiert, zum der langen Expositionsdauer zu verwenden, die Fluoreszenzbilder zu erhalten. Zwecks mögliche Bleiche zu vermeiden bewirkt uns schloss den Fluoreszenzfensterladen während der Anwendung von DA und öffnete ihn kurz vor dem Erwerb des Bildes.

Zusätzlich zur Fluoreszenzdarstellung DA - D1-receptor befreiende Kräfte wurden unter Verwendung des FLUGHANDBUCH-Kraftvolumenmodus auf lebenden Zellen an den verschiedenen Zeitpunkten im Vorhandensein und in Ermangelung des Dopamins aufgezeichnet. Kraftvolumendarstellung einer Einzelzelle mit einer Spitze DA-functionalized an Zeitpunkt t0 (keine Stimulierung von D1-receptors) ergab einen signifi Neigungsteil (13,12%) Kraftkurven, die ein spezifisches befreiendes Ereignis aufweisen (Abbildung 2C).

Parallel zu den optischen Beobachtungen, wurden die Kraftmessungen auch an Zeitpunkt t durchgeführt10min (nach Stimulierung von D1-receptors durch DA). Wie in Abbildung 2D gezeigt, wiesen alle aufgezeichneten Kraftkurven nicht spezifisches befreiendes Ereignis auf und so unterstützten unsere Beobachtungen durch Fluoreszenzdarstellung der Internalisierung des D1-receptors in den Cytosol. Wir fanden nicht dieses Phänomen, um sogar nach 1 Stunde DA-Stimulierung umschaltbar zu sein. Vergleich von Bildern und von Zeitversehen Filmen bestätigte, dass die beobachtete Änderung des Fluoreszenzmusters eine direkte Konsequenz des Internalisierungsprozesses ist.

Ergebnisse

In unseren Studien DA - Di-Empfänger Interaktionen wiesen eine einzelne befreiende Kraft auf, die um 223 ± 82 pN zentriert wurde. Interessant war der Mittelhöchstwert stabil, als gemessen am Rand der Zelle, während stärkste Varianten und höhere Werte für die Maße beobachtet wurden, die nahe dem Zellkern genommen wurden. Bis jetzt wird die Interaktionsvorrichtung zwischen Dopamin und seinem Empfänger nicht völlig verstanden. Studien berichten den pharmazeutischen Eigenschaften des Dopamins sowie vielen seiner Agonisten und Antagonisten, seine möglichen Empfänger. Abhängig von dem Empfängerbaumuster wurden die Dissoziationskonstanten gefunden, um zwischen 880 und 2980 nm zu sein.

Dynamische Kraftspektroskopie kann für Bestimmung von kinetischen Parametern auch verwendet werden. In unserer Arbeitsinstallation wurden alle FLUGHANDBUCH-Scans unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, aber es ist auch möglich, sich die Scannenparameter zu unterscheiden und die befreiende Kraft als Funktion der Belastungsrate grafisch darzustellen. Kurvenweiterentwicklung kann Informationen zur Verfügung stellen ob, wenn Kinetik des befreienden Prozesses von der inneren oder äußeren Sperre der Energielandschaft abhängiger ist. Die kinetische AusRatekonstante (K)off der Auflösung kann entschlossen auch sein.

Durch im Wesentlichen die Beitrittskraft als Funktion des Logarithmus der Belastungsrate während des Einfahrens grafisch darstellend, während decken halten konstant die Interaktionszeit und die Anflugdrehzahl, die Längenschuppe der Energiesperre auf. Extraoplation der Kurve an Kraft null gibt K.off

andererseits gibt die grafische Darstellung der Beitrittsfrequenz als Funktion der Interaktionszeit, beim Halten konstant des Anfluges und der Einfahrendrehzahl die Interaktionszeit, die für halb-maximale Wahrscheinlichkeit des Bindens erforderlich ist. Schließlich die Vereinigungskinetikkonstante (K) kennendon, kann die Gleichgewichtskonstante bestimmt werden, wie folgt: KD = K/Koffon.

Schlussfolgerung

Die anwesende Untersuchung zeigt das Potenzial kombinierter FLUGHANDBUCH- und Fluoreszenzmikroskopie, das Vorhandensein und die Bindefähigkeiten des Dopamins D1-receptors auf der Oberfläche von Livezellen zu studieren. In dieser zweiteiligen Reihe Anwendungs-Anmerkungen über den Gebrauch FLUGHANDBUCHS in der Studie von neurodegenerativen Erkrankungen (Sehen Sie AN117: Zerteilen Sie I) die Experimente, die auf die Integration von zwei bedeutenden Techniken gerichtet werden, die in den Biowissenschaftsanwendungen verwendet werden. Die Kombination von optischen Mikroskopietechniken mit FLUGHANDBUCH gewährt:

  1. Kennzeichen 3D von Molekülen von Zinsen durch BF, DIC, Fluoreszenz und FLUGHANDBUCH-Höhenbilder.
  2. Untersuchung der physikalischen Eigenschaften des Zielmoleküls durch optische Darstellung und die topographische, der Reibung, viskoelastischer und des Beitrittes Daten.
  3. Echtzeitbeobachtung eines zellulären Signalisierenereignisses an der Submikronschuppe.
  4. Maß der spezifischen befreienden Kraft zwischen einem Ligand und seinem Empfänger und in einem weiteren Umfang, Bestimmung ihrer kinetischen Parameter. Diese letzte Option öffnet enorme Möglichkeiten auf dem Gebiet von Pharmakologie, besonders Drogenentdeckung.

Indem es optische Mikroskopie mit FLUGHANDBUCH kombiniert, versieht dieses nicht nur Benutzer mit dem Nutzen beider Techniken in einem einzelnen Experiment, bietet es auch einfachen Zugriff zur Probe und eine hohe Flexibilität der Manipulation an. Wir glauben, dass diese Studien überzeugende Ergebnisse hinsichtlich des Wertes solcher multimodalen Instrumentierung zur Verfügung stellen und helfen werden, Fortschritte in der Neurologieforschung zu beschleunigen.

Diese Informationen sind Ursprungs- angepasst gewesen, wiederholt und von den Materialien, die von Nano-Oberflächen Bruker bereitgestellt werden.

Zu mehr Information über diese Quelle besuchen Sie bitte Nano-Oberflächen Bruker.

Date Added: Jun 22, 2009 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:11

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