Estudiar la Acción Recíproca Entre la Dopamina y D1-Receptor en Células de SH-SY5Y usando Microscopia Atómica de la Fuerza

Temas Revestidos

Introducción
Preparación de la Muestra
Usando el AFM Para Seguir Su Trayectoria los Receptores del Membrana-Salto D1 de la Dopamina Que Van De Borrachera
Resultados
Conclusión

Introducción

Además de sus capacidades de alta resolución de la proyección de imagen, la microscopia atómica de la fuerza (AFM) ha emergido como herramienta potente para medir las propiedades nanomechanical y las fuerzas de la acción recíproca de complejos biomoleculares. Mientras Que la mayoría de estos tipos de estudios del AFM ha conducto en las moléculas aisladas, porque la importancia biológica verdadera estas investigaciones se deben conducto idealmente en sistemas vivos de la célula.

Además, aparece esencial ahora poder acoplar el AFM con otras técnicas como microscopia óptica para cerco simultáneamente ambos tipos de datos. Hasta ahora, muy pocos estudios se basan en la combinación del AFM y de la microscopia óptica invertida.

En el actual estudio investigamos la aplicación potencial de las mediciones de la fuerza en vigilar la reacción y las propiedades obligatorias del receptor de la dopamina D1 sobre el estímulo con dopamina. Utilizamos un sistema completo integrado del AFM y del epifluorescence para correlacionar mediciones de la proyección de imagen de la fluorescencia y de la fuerza del AFM.

La Dopamina (DA, 4 (2-aminoethyl) benzene-1,2-diol) es un neurotransmisor importante que pertenece a la familia de la catecolamina, sobre la base de un aminoácido aromático llamado tirosina, y es el precursor de dos hormonas principales: adrenalina y noradrenalin.

En el sistema nervioso periférico, el papel principal de la dopamina es modular funciones cardiovasculares como un analeptic, una rotación de la hormona, una función renal, un flujo vascular y movilidad gastrointestinal. En el sistema nervioso central (CNS), la dopamina está implicada en el mando de funciones, de la cognición, de la emoción, de la toma de comida y de la regla locomotoras de la endocrina. La Disfunción de la neurotransmisión dopaminérgica en el CNS se conecta a una variedad de desordenes neuropsiquiátricos, incluyendo el síndrome de Tourette, la enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia, la paranoia, y el desorden de la hiperactividad del déficit de Atención (ADHD). Los receptores de la Dopamina se clasifican de D1 a D5 cuyo los receptores D1 y D2 componen la proporción más grande. Para el tratamiento de estas enfermedades la identificación de las drogas dopaminérgicas faltas de efectos secundarios es uno de los retos más grandes de la investigación y del descubrimiento neuronales de la droga.

En este estudio determinado, utilizamos un receptor YFP-etiqueta de la transmembrana D1 para investigar la ciudad del specifi de la acción recíproca entre este receptor y una punta del AFM del ed de la dopamina-modifi, usando la espectroscopia de la fuerza y las características ópticas de la proyección de imagen de nuestra herramienta integrada.

Preparación de la Muestra

Las células de SH-SY5Y transfected con el receptor YFP-marcado con etiqueta de la Dopamina D1 (DRD1-EYFP). La Transfección fue realizada por el nucleofection (Nucelofector, AMAXA) usando una suspensión de la célula (106 cells/ml), la DNA de 4 plásmidos del µg, y el almacenador intermediaro de la transfección de 100 µl (AMAXA). Posteriormente, las células fueron sembradas en los errores estéril de la tapa (18x18 milímetro) en 6 placas bien. 48 h después de las células adherentes de la transfección que expresaban el DRD1-EYFP fueron estimulados con clorhidrato de la Dopamina del µM 10-50.

Las imágenes (BF) de Brightfield, de DIC y del epifluorescence fueron detectadas en un microscopio invertido del Observador de Zeiss Axio equipado de una cámara de AxioCam MRC y del software de AxioVision. Todas Las imágenes del AFM fueron registradas en un AFM que se ha integrado completo con el microscopio óptico, usando los voladizos de DNP/MSCT.

Todos Los experimentos fueron realizados en contacto y TappingMode™ usando el almacenador intermediaro y el DNP- y el MSCT-tipo más suaves voladizos (constante nominal 0,06 N/m y los 0.01N/m de PBS del muelle, respectivamente.). Los voladizos de Dopaminefunctionalized fueron preparados según lo descrito previamente.

Abreviadamente, un derivado (PEG) del polietilenglicol, teniendo un extremo amino-reactivo y un extremo tiol-reactivo, fue utilizado como máquina para hacer chorizos y como molécula lling inerte detrás-fi de modo que solamente la dopamina pudiera contribuir a las acciones recíprocas obligatorias observadas. Los constantes del Muelle eran calculados en líquido en un soporte derecho (parte inferior de cristal de la Placa de Petri) y las sensibilidades de desviación fueron puestas al día manualmente en el software. Un total de curvas de 3072 fuerzas fueron registradas modo del volumen de en vigor, al tipo de exploración entre 3 y 3,5 Hertz, y con un retraso del retractar del Ms 10. El área de la exploración era el µm 2x2.

Usando el AFM Para Seguir Su Trayectoria los Receptores del Membrana-Salto D1 de la Dopamina Que Van De Borrachera

Los receptores YFP-marcados con etiqueta overexpressed D1 localizan principal en la membrana de plasma y muestran una distribución al azar en células neuronales de SH-SY5Y. De Acuerdo con datos de la fluorescencia los receptores internan en el citoplasma sobre el estímulo con dopamina. Para utilizar esta hipótesis y probar la aplicación potencial del AFM, seguimos su trayectoria el atascamiento de los receptores del membrana-salto D1 de DA y de su internalización subsiguiente.

Primero, los voladizos de DNP functionalized con un análogo de la dopamina como se ilustra en el Cuadro 1. En el paso de progresión siguiente las células vivas fueron expuestas a varias concentraciones de DA a partir del 10 al µM 50 para estimular los receptores de la membrana D1.

Cuadro 1. acciones recíprocas del ligand-receptor Que Estudian en una célula viva. La punta del AFM functionalized de una manera tal que las mitades químicas de dopamina (DA) implicadas en la acción recíproca con su D1-receptor se preserven. Además, la longitud del espaciador disminuye el efecto de la punta sobre la acción recíproca sí mismo.

Las imágenes del epifluorescence y las películas del timelapse fueron registradas para detectar cambios en la señal fluorescente de la distribución del receptor D1 y por lo tanto, de investigar la internalización y las propiedades obligatorias de la dopamina YFP-marcada con etiqueta D1-receptor.

La Figura 2A muestra el experimento en t0: en esta punta del tiempo, la dopamina no se ha aplicado y así, los receptores D1 no se estimulan. Como consecuencia, los receptores YFP-marcados con etiqueta D1 siguen siendo membrana-salto que revela una coloración fluorescente homogénea a través de la superficie de la célula. Un cambio importante en la distribución fluorescente es logrado sobre el estímulo del D1-receptor por DA. La Figura 2B muestra un ejemplo típico de las imágenes registradas en el T.10min Para todas las concentraciones de DA, no se detectó ningún uorescence de la membrana la Florida después de la incubación de 10 minutos.

El Cuadro 2. proyección de imagen de la fluorescencia Que Correlaciona y AFM fuerza mediciones. La punta del AFM fue marcada con etiqueta con un análogo de DA para seguir la ubicación de D1-receptors YFP-marcado con etiqueta antes y después de aplicar a DA libre. Antes del estímulo de DA, los receptores son membrana-salto de la célula y así, la fluorescencia se distribuye por todo la superficie de la célula (a) y las curvas de la fuerza exhiben un alto porcentaje de las acciones de desatadura específicas (c). 10 minutos después de la aplicación de DA, toda la fluorescencia se concentra en los pequeños puntos (b) y no se registra ningunas acciones del specifi c el volumen de en vigor que prueba que todos los receptores se han internado en el cytosol.

En Lugar, las pequeñas vesículas fluorescentes intracelulares múltiples variables de tamaño y brillantez fueron observadas el indicar de la internalización posible del receptor (Figura 2B). Las puntas de Esta observación a un atascamiento activo del ligand DA al receptor D1 en la célula de SH-SY5Y modelan. Observe que la fluorescencia débil hace señales requerido nos para utilizar tiempos de exposición largos para obtener las imágenes de la fluorescencia. Para evitar el blanqueo posible nos efectúa cerró el obturador de la fluorescencia durante la aplicación de DA y lo abrió momentos antes de detectar la imagen.

Además de proyección de imagen de la fluorescencia, DA - las fuerzas de desatadura de D1-receptor fueron registradas usando modo del volumen de la fuerza del AFM en las células vivas en diversas puntas del tiempo en la presencia y la ausencia de dopamina. La proyección de imagen del volumen de la Fuerza de una célula con una punta DA-functionalized en la punta t (0 ningún estímulo del tiempo de D1-receptors) dio lugar a una porción del canto del signifi (13,12%) de curvas de la fuerza que exhibían una acción de desatadura específica (Figura 2C).

Paralelamente a las observaciones ópticas, las mediciones de la fuerza también fueron realizadas en la punta t del tiempo10min (después del estímulo de D1-receptors de DA). Tal y como se muestra en de la Figura 2.a, todas las curvas registradas de la fuerza exhibieron la acción de desatadura no específica, así utilizando nuestras observaciones por la proyección de imagen de la fluorescencia de la internalización del D1-receptors en el cytosol. No encontramos este fenómeno para ser reversibles incluso después 1 hora de estímulo de DA. La Comparación de imágenes y de películas del time lapse confirmó que el cambio observado del modelo de la fluorescencia es una consecuencia directa del proceso de la internalización.

Resultados

En nuestros estudios, DA - las acciones recíprocas del DI-receptor exhibieron una única fuerza de desatadura centrada alrededor 223 del ± 82 pN. Interesante, el valor máximo medio era estable cuando estaba medido en el borde de la célula, mientras que las variaciones más fuertes y valores más altos fueron observados para las mediciones tomadas cerca del núcleo de célula. Hasta la fecha, el mecanismo de la acción recíproca entre la dopamina y su receptor no se entiende completo. Los Estudios señalan las características farmacéuticas de la dopamina, así como muchas de sus agonistas y antagonistas, a sus receptores potenciales. Dependiendo del tipo del receptor, los constantes de la disociación fueron encontrados para estar entre 880 y 2980 nanómetro.

La espectroscopia Dinámica de la fuerza se puede también utilizar para la determinación de parámetros cinéticos. En nuestro ajuste de trabajo, todas las exploraciones del AFM fueron realizadas bajo mismas condiciones, pero es también posible variar los parámetros de la exploración y trazar la fuerza de desatadura en función de la velocidad de carga. La progresión de la Curva puede proporcionar a la información si si la cinética del proceso de desatadura es más relacionada en la barrera interna o exterior del paisaje de la energía. El constante cinético del lejos-tipo (k)off de la disociación puede también ser resuelto.

Por esencialmente, trazando la fuerza de la adherencia en función del logaritmo de la velocidad de carga durante la contracción, mientras que la custodia constante el tiempo de acción recíproca y la velocidad de aproximación, revelarán la escala de la longitud de la barrera de energía. Extraoplation de la curva en la fuerza cero dará el K.off

por otra parte, el trazado de la frecuencia de la adherencia en función del tiempo de acción recíproca mientras que guarda constante la aproximación y la velocidad de la contracción dará la época de acción recíproca necesaria para la probabilidad mitad-máxima de atar. Finalmente, conociendo el constante del tipo de la asociación (k)on, el constante de equilibrio puede ser determinado como sigue: KD = K/Koffon.

Conclusión

La actual investigación demuestra el potencial de la microscopia combinada del AFM y de fluorescencia de estudiar la presencia y las propiedades obligatorias de la dopamina D1-receptors en la superficie de células vivas. En esta serie bipartita de Notas de Aplicación sobre el uso del AFM en el estudio de enfermedades neurodegenerative (Véase AN117: Pieza los experimentos de I) centrados en la integración de dos técnicas importantes usadas en aplicaciones de las ciencias de la vida. Combinar técnicas ópticas de la microscopia con el AFM permite:

  1. identificación 3D de moléculas del interés por el FB, DIC, fluorescencia e imágenes de la altura del AFM.
  2. Investigación de las propiedades físicas de la molécula de la meta con proyección de imagen óptica y datos topográficos, de la fricción, viscoelásticos, y de la adherencia.
  3. observación en tiempo real de una acción celular de la transmisión de señales en la escala del submicron.
  4. Medición de la fuerza de desatadura específica entre un ligand y su receptor, y a otro fragmento, determinación de sus parámetros cinéticos. Esta última opción abre posibilidades enormes en el campo de la farmacología, especialmente descubrimiento de la droga.

Combinando microscopia óptica con el AFM, esto no sólo provee de utilizadores las ventajas de ambas técnicas en un único experimento, también ofrece de fácil acceso a la muestra y una alta adaptabilidad de la manipulación. Creemos que estos estudios proporcionan a resultados convincentemente en cuanto al valor de tal instrumentación multimodal y ayudarán a apresurar avances en la investigación de la neurología.

Esta información ha sido originaria, revisada y adaptada de los materiales proporcionados por las Superficies Nanas de Bruker.

Para más información sobre esta fuente visite por favor las Superficies Nanas de Bruker.

Date Added: Jun 22, 2009 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:29

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