Étude de l'Interaction Entre la Dopamine et le D1-Receptor en Cellules de SH-SY5Y utilisant la Microscopie Atomique de Force

Sujets Couverts

Introduction
Préparation des Échantillons
Utilisant l'AFM Pour Cheminer la Dopamine Noçant aux Récepteurs D1 Liés par membrane
Résultats
Conclusion

Introduction

En plus de ses capacités de haute résolution de représentation, la microscopie atomique de force (AFM) a apparu comme puissant outil pour mesurer les propriétés nanomechanical et des forces d'interaction des composés biomoléculaires. Tandis Que la majorité de ces types d'études d'AFM ont été conduites sur les molécules d'isolement, parce que la véritable pertinence biologique ces investigations devraient idéalement être conduites sur les systèmes sous tension de cellules.

De plus, il semble maintenant essentiel de pouvoir accoupler l'AFM avec d'autres techniques comme la microscopie optique afin de rassembler simultanément les deux types de données. Jusqu'ici, très peu d'études sont basées sur la combinaison de l'AFM et de la microscopie optique inversée.

Dans la présente étude nous avons vérifié l'application possible des mesures de force en surveillant la réaction et les propriétés de liage du récepteur de la dopamine D1 sur la stimulation avec de la dopamine. Nous avons utilisé un système entièrement intégré d'AFM et d'epifluorescence pour marquer des mesures de représentation de fluorescence et de force d'AFM.

La Dopamine (DANEMARK, 4 (2-aminoethyl) benzene-1,2-diol) est une neurotransmetteur importante appartenant à la famille de catécholamine, basée sur une tyrosine appelée d'acide aminé aromatique, et est le précurseur de deux hormones principales : adrénaline et noradrenalin.

Dans le système nerveux périphérique, le rôle principal de la dopamine est de moduler des fonctions cardio-vasculaires comme analeptique, rotation d'hormone, fonction rénale, flux vasculaire et motilité de gastro-intestinal. Dans le système nerveux central (CNS), la dopamine est concernée dans le contrôle des fonctionnements, de la cognition, de l'émotion, de la ration alimentaire et du règlement locomoteurs d'endocrine. Le Dysfonctionnement de la neurotransmission dopaminergique dans les CNS est lié à un grand choix de troubles neuropsychiatriques, le trouble d'hyperactivité y compris le Syndrome de la Tourette, la Maladie de Parkinson, la schizophrénie, la paranoïa, et d'Attention déficit (TDAH). Des Récepteurs dopaminergiques sont classifiés de D1 à D5 dont les récepteurs D1 et D2 composent la plus grande part. Pour la demande de règlement de ces maladies l'identification des médicaments dopaminergiques exempts d'effets secondaires est l'un des défis importants dans la recherche et la découverte de médicaments neuronales.

Dans cette étude particulière, nous avons utilisé un récepteur YFP-étiqueté de la transmembrane D1 pour vérifier la ville de specifi de l'interaction entre ce récepteur et une extrémité d'AFM d'ed de dopamine-modifi, utilisant la spectroscopie de force et les caractéristiques techniques optiques de représentation de notre outil intégré.

Préparation des Échantillons

Les cellules de SH-SY5Y étaient transfecté avec le récepteur YFP-étiqueté de la Dopamine D1 (DRD1-EYFP). La Transfection a été effectuée par nucleofection (Nucelofector, AMAXA) utilisant une suspension de cellules (106 cells/ml), 4 plasmides ADN de µg, et tampon de transfection de 100 µl (AMAXA). Ultérieurement, des cellules ont été injectées sur les fiches de transmission stériles de panneau (18x18 millimètre) dans des 6 plaques bonnes. 48 h après les cellules adhérentes de transfection exprimant le DRD1-EYFP ont été stimulés avec du chlorhydrate de Dopamine du µM 10-50.

Des images (BF) de Brightfield, de DIC et d'epifluorescence ont été saisies sur un microscope inversé d'Observateur de Zeiss Axio équipé d'un appareil-photo d'AxioCam MRC et du logiciel d'AxioVision. Toutes Les images d'AFM ont été enregistrées sur un AFM qui a été entièrement intégré avec le microscope optique, utilisant des encorbellements de DNP/MSCT.

Toutes Les expériences ont été effectuées en contact et TappingMode™ utilisant le tampon de PBS et les encorbellements de DNP- les plus mous et de type MSCT (constante nominale 0,06 N/m et 0.01N/m de source, respectivement.). Des encorbellements de Dopaminefunctionalized ont été préparés comme décrit précédemment.

Brièvement, un dérivé (PEG) de polyéthylène glycol, ayant une extrémité aminé-réactive et une extrémité thiol-réactive, a été utilisé comme éditeur de liens et comme molécule de retour-fi lling inerte de sorte que seulement la dopamine ait pu contribuer aux interactions obligatoires observées. Des constantes de Source ont été prévues en liquide sur un support raide (bas en verre de la boîte de Pétri) Et les sensibilités de déviation étaient manuellement actualisées en logiciel. Un total de courbures de 3072 forces ont été enregistrées en le mode de volume de vigueur, aux tarifs d'échographie entre 3 et 3,5 Hertz, et avec un délai de rétraction de Mme 10. La zone d'échographie était le µm 2x2.

Utilisant l'AFM Pour Cheminer la Dopamine Noçant aux Récepteurs D1 Liés par membrane

Les récepteurs D1 YFP-étiquetés overexpressed localisent principalement dans la membrane de plasma et affichent une distribution irrégulière en cellules neuronales de SH-SY5Y. Basé sur des données de fluorescence que les récepteurs internalisent dans le cytoplasme sur la stimulation avec de la dopamine. Afin de supporter cette hypothèse et tester l'application possible de l'AFM, nous avons cheminé le grippement du DANEMARK aux récepteurs D1 liés par membrane et à leur intériorisation ultérieure.

D'abord, des encorbellements de DNP functionalized avec un analogue de dopamine comme illustré sur le Schéma 1. Dans la prochaine phase les cellules sous tension ont été exposées à plusieurs concentrations du DANEMARK de 10 au µM 50 afin de stimuler les récepteurs de la membrane D1.

Le Schéma 1. interactions de Étude de ligand-récepteur sur une cellule vivante. L'extrémité d'AFM functionalized de telle manière que les parties chimiques de dopamine (DA) concernées dans l'interaction de son D1-receptor soient préservées. De plus, la longueur de l'espaceur réduit à un minimum l'effet de l'extrémité sur l'interaction lui-même.

Des images d'epifluorescence et les films de timelapse ont été enregistrés pour trouver des changements du signe fluorescent de distribution du récepteur D1 et par conséquent, de vérifier l'intériorisation et les propriétés de liage de la dopamine YFP-étiquetée D1-receptor.

La Figure 2A affiche l'expérience à t0 : à ce moment remarque, la dopamine n'a pas été appliquée et ainsi, les récepteurs D1 ne sont pas stimulés. En conséquence, les récepteurs D1 YFP-étiquetés restent liés par membrane indiquant une souillure fluorescente homogène en travers de la surface de cellules. Une évolution important dans la distribution fluorescente est réalisée sur la stimulation du D1-receptor par le DANEMARK. La Figure 2B affiche un cas particulier des images enregistrées au T.10min Pour toutes les concentrations du DANEMARK, aucun uorescence de la membrane la Floride n'a été trouvé après incubation de 10 mn.

Le Schéma 2. représentation Marquante de fluorescence et AFM forcent des mesures. L'extrémité d'AFM a été étiquetée avec un analogue du DANEMARK pour suivre l'emplacement de D1-receptors YFP-étiqueté avant et après appliquer le DANEMARK libre. Avant stimulation par le DANEMARK, les récepteurs sont cellule liée par membrane et ainsi, la fluorescence est distribuée partout dans la surface de cellules (a) et les courbures de force montrent un pourcentage élevé d'événements défaisants particuliers (c). 10 mn après application du DANEMARK, toute la fluorescence est concentrée dans les points de petit (b) et aucun événement du specifi c n'est enregistré en le volume de vigueur montrant que tous les récepteurs ont été internalisés dans le cytosol.

Au Lieu De Cela, la petite on a observé variable fluorescente intracellulaire multiple de vésicules dans la taille et la brilliance indiquer l'intériorisation possible de récepteur (Figure 2B). Les remarques de Cette observation à un grippement actif du ligand DANEMARK au récepteur D1 dans la cellule de SH-SY5Y modélisent. Notez que la faible fluorescence signale requis nous pour utiliser de longues durées d'exposition d'obtenir les images de fluorescence. Afin d'éviter le blanchiment possible nous effectue a fermé le volet de fluorescence pendant la demande du DANEMARK et l'a ouvert juste avant saisir l'image.

En plus de la représentation de fluorescence, le DANEMARK - des forces défaisantes de D1-receptor ont été enregistrées utilisant le mode de volume de force d'AFM sur les cellules vivantes à différentes remarques de temps en la présence et l'absence de la dopamine. La représentation de volume de Force d'une cellule avec une extrémité Danemark-functionalized à la remarque t (0 aucune stimulation de temps de D1-receptors) a eu comme conséquence une partie de pente de signifi (13,12%) de courbures de force montrant un événement défaisant particulier (Figure 2C).

En Parallèle aux observations optiques, les mesures de force ont été également exécutées à la remarque t de temps10min (après stimulation de D1-receptors par le DANEMARK). Suivant les indications de la Figure 2D, toutes les courbures enregistrées de force n'ont montré l'événement défaisant pas particulier, de ce fait supportant nos observations par la représentation de fluorescence de l'intériorisation du D1-receptors dans le cytosol. Nous n'avons pas trouvé ce phénomène pour être réversibles même après 1 heure de stimulation du DANEMARK. La Comparaison des images et des films de temps-déchéance a confirmé que la modification observée de la configuration de fluorescence est un effet direct du procédé d'intériorisation.

Résultats

Dans nos études, le DANEMARK - les interactions de Di-récepteur ont montré une force défaisante unique concentrée sur 223 le ± 82 NA. Intéressant, la moyenne valeur de crête était stable une fois mesurée à l'arête de la cellule, attendu qu'on a observé les variations et les valeurs supérieures les plus intenses pour des mesures prises près du noyau de cellules. Jusqu'à présent, le mécanisme d'interaction entre la dopamine et son récepteur n'est pas entièrement compris. Les Études indiquent les caractéristiques pharmaceutiques de la dopamine, ainsi que plusieurs de ses agonistes et antagonistes, à ses récepteurs potentiels. Selon les types de récepteur, les constantes de dissociation se sont avérées entre 880 et 2980 nanomètre.

La spectroscopie Dynamique de force peut également être utilisée pour la détermination des paramètres cinétiques. Dans notre installation fonctionnante, toutes les échographies d'AFM ont été exécutées dans les mêmes conditions, mais il est également possible de varier les paramètres de lecture et de tracer la force défaisante en fonction du taux de chargement. L'étape progressive de Courbure peut fournir des informations de savoir si si la cinétique du procédé défaisant est à la charge du barrage intérieur ou externe de l'horizontal d'énergie. La constante cinétique de hors circuit-rate (k)off de la dissociation peut également être déterminée.

Par essentiellement, le traçage de la force d'adhérence en fonction du logarithme du taux de chargement pendant la rétraction, tout en maintenant la constante le temps d'interaction et la vitesse d'élan, indiquera l'échelle de longueur du barrage d'énergie. Extraoplation de la courbure à la force zéro donnera le K.off

d'autre part, traçant la fréquence d'adhérence en fonction du temps d'interaction tout en maintenant la constante l'élan et la vitesse de rétraction donneront le moment d'interaction nécessaire pour la probabilité moitié-maximale de gripper. En Conclusion, connaissant la constante de tarifs d'association (k)on, la constante d'équilibre peut être déterminée comme suit : KD = K/Koffon.

Conclusion

La présente enquête explique le potentiel de l'AFM combiné et de la microscopie à fluorescence d'étudier la présence et les propriétés de liage de la dopamine D1-receptors sur la surface des cellules sous tension. Dans cette suite en deux parties de Notes d'Application sur l'utilisation de l'AFM dans l'étude des maladies neurodegenerative (Voir l'AN117 : Pièce I) les expériences concentrées sur l'intégration de deux techniques importantes utilisées dans des applications des sciences de la vie. La Combinaison des techniques optiques de microscopie avec l'AFM laisse :

  1. identification 3D des molécules d'intérêt par le FB, le DIC, la fluorescence et des images de la hauteur d'AFM.
  2. Enquête sur les propriétés physiques de la molécule-cible par la représentation optique et les données topographiques, de friction, visco-élastiques, et d'adhérence.
  3. observation en temps réel d'un événement cellulaire de signalisation à l'échelle submicronique.
  4. Mesure de la force défaisante particulière entre un ligand et son récepteur, et jusqu'un autre à degré, détermination de leurs paramètres cinétiques. Cette dernière option ouvre des possibilités énormes dans le domaine de la pharmacologie, particulièrement découverte de médicaments.

En combinant la microscopie optique avec l'AFM, ceci fournit non seulement à des utilisateurs les avantages des deux techniques dans une expérience unique, il offre également l'accès facile à l'échantillon et une souplesse élevée de manipulation. Nous croyons que ces études fournissent des résultats d'une façon convaincante pour la valeur d'une telle instrumentation multimodale et aideront à accélérer des avances dans la recherche en matière de neurologie.

Cette information a été originaire, révisée et adaptée des matériaux fournis par des Surfaces de Nano de Bruker.

Pour plus d'informations sur cette source visitez s'il vous plaît les Surfaces de Nano de Bruker.

Date Added: Jun 22, 2009 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:09

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