원자 군대 현미경 검사법을 사용하는 SH-SY5Y 세포에 있는 도파민과 D1 수용체 사이 상호 작용 공부

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소개
견본 준비
도파민 마시고 떠들 막 경계 D1 수용체를 추적하는 AFM 사용하기
결과
결론

소개

그것의 고해상 화상 진찰 기능 이외에, 원자 군대 현미경 검사법은 (AFM) 생체 고분자 복합물의 nanomechanical 속성 그리고 상호 작용 군대 둘 다 측정을 위한 강력한 공구로 나왔습니다. AFM 연구 결과의 이 모형의 대다수가 고립되는 분자, 왜냐하면 확실한 생물학 관련성에 수행되는 동안 이 수사는 살아있는 세포 시스템에 이상적으로 진행되어야 합니다.

추가적으로, 지금 동시에 데이터의 두 모형 다 집합하기 위하여 광학적인 현미경 검사법 같이 그밖 기술을 가진 AFM를 결합할 수 있을 것이 것입니다 필수로 보입니다. 지금까지, 아주 몇몇 연구 결과는 AFM와 거꾸로 한 광학적인 현미경 검사법의 조합에 근거를 둡니다.

존재하는 연구 결과에서 우리는 도파민을 가진 자극에 도파민 D1 수용체의 반응 그리고 바인드 재산 감시에 있는 군대 측정의 잠재적인 응용을 조사했습니다. 우리는 완전히 통합 AFM와 epifluorescence 형광 화상 진찰과 AFM 군대 측정을 상관하기 위하여 시스템을 이용했습니다.

도파민은 (DA 의 4 (2 아미노에틸) 벤젠 1,2 디올) 티로신에게 불린 방향족 아미노산에 근거하여 카테콜아민 가족에, 속하는 중요한 신경전달물질이고, 2개 주요 호르몬의 선구자입니다: 아드레날린과 noradrenalin.

말초 신경계에서는, 도파민의 주요 역할은 강장제, 호르몬 회전율, 신장 기능, 관 교류 및 위장 운동성으로 심장 혈관 기능을 조절하기 위한 것입니다. 중앙 신경 조직에서는 (CNS), 도파민은 운동 기능, 인식, 정서, 음식 섭취량 및 내분비선 규칙의 통제에서 관련시킵니다. CNS에 있는 dopaminergic neurotransmission의 역기능은 Tourette의 증후군, Parkinson의 질병, 정신 분열증, 망상광 및 주의력 결핍을 포함하여 다양한 신경정신병 무질서에, 기능 항진 무질서 (ADHD) 연결됩니다. 도파민 수용체는 D1에서 D1와 D2 수용체가 가장 큰 비율을 구성하는 D5에 분류됩니다. 이 질병의 처리를 위해 부작용 이 없는 dopaminergic 약의 식별은 신경원 연구 및 약 발견에 있는 큰 도전의 한개입니다.

이 특정한 연구 결과에서는, 우리는 YFP 레테르를 붙인 막 횡단 D1 우리의 통합 공구의 군대 분광학 그리고 광학적인 화상 진찰 특징 둘 다를 사용하여 이 수용체와 도파민 modifi ed AFM 끝 사이 상호 작용의 specifi 도시를, 조사하기 위하여 수용체를 사용했습니다.

견본 준비

SH-SY5Y 세포는 YFP 표를 붙인 도파민 D1 수용체 (DRD1-EYFP)로 transfected. Transfection는 nucleofection (Nucelofector, AMAXA)에 의해 세포 현탁액 (10 cells/ml),6 4개의 µg 플라스미드 DNA 및 100개의 µl transfection 버퍼 (AMAXA)를 사용하여 능력을 발휘했습니다. 그후에, 세포는 6-well 격판덮개에서 메마른 덮개 미끄러짐 (18x18 mm)에 씨를 뿌렸습니다. DRD1-EYFP를 표현하는 10-50 µM 도파민 염산염으로 transfection 부착한 세포 후에 48 h는 자극되었습니다.

Brightfield (BF), DIC 및 epifluorescence 심상은 AxioCam MRC 사진기 및 AxioVision 소프트웨어로 갖춰진 Zeiss Axio 관찰자 거꾸로 한 현미경에 취득되었습니다. 모든 AFM 심상은 광학적인 현미경과 완전히 통합된 AFM에 DNP/MSCT 외팔보를 사용하여 기록되었습니다.

모든 실험은 PBS 버퍼 및 가장 연약한 DNP- 및 MSCT 모형 외팔보 (명목상 봄 불변의 것 0.06 N/m와 0.01N/m, 각각.)를 사용하여 접촉에서와 TappingMode™ 능력을 발휘했습니다. Dopaminefunctionalized 외팔보는 이전에 기술되는 것과 같이 준비되었습니다.

간단히, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 유래물은, 아미노 민감하는 끝 및 티올 민감하는 끝이 있어서, 링커와 비활성 후에 fi lling 분자로 도파민만 관찰한 의무적인 상호 작용에 기여할 수 있었다 그래야 이용되었습니다. 봄 불변의 것은 뻣뻣한 지원 (세균 배양용 접시의 유리제 바닥)에 액체에서 산출되었습니다 편향도 감도는 소프트웨어에서 수동으로 경신되고. 3072의 군대 곡선 토탈은 군대 양 최빈값에서, 3개 그리고 3.5 Hz 사이 검사 비율로, 그리고 10 Ms의 끌어 넣 지연으로 기록되었습니다. 검사 지역은 2x2 µm이었습니다.

도파민 마시고 떠들 막 경계 D1 수용체를 추적하는 AFM 사용

overexpressed YFP 표를 붙인 D1 수용체는 원형질막에서 주로 지방화하고 신경원 SH-SY5Y 세포에 있는 무작위 배급을 보여줍니다. 형광 데이터에 기지를 두어 수용체는 도파민을 가진 자극에 세포질로 내면화합니다. 이 가설을 지원하고 AFM의 잠재적인 응용을 시험하기 위하여, 우리는 DA 막 경계 D1 수용체와 그들의 연속적인 내면화의 바인딩을 추적했습니다.

첫째로, DNP 외팔보는 숫자 1.에서 설명되는 것과 같이 도파민 아날로그에 functionalized. 다음 단계에서 살아있는 세포는 10에서 50 µM에 몇몇 DA 사격량에 D1 막 수용체를 자극하기 위하여 드러냈습니다.

생세포에 숫자 1. 공부 ligand 수용체 상호 작용. AFM 끝은 그것의 D1 수용체로 상호 작용에서 관련시킨 (DA) 도파민의 화학 모이어티가 보존하다 그런 방법으로 functionalized. 추가적으로, 간격 장치의 길이는 상호 작용에 대한 끝의 효력 자체를 극소화합니다.

epifluorescence 둘 다 심상과 timelapse 영화는과 그 결과로, YFP 표를 붙인 도파민 D1 수용체의 내면화 그리고 바인드 재산을 조사하는 D1 수용체 배급의 형광성 신호에 있는 변경을 검출하기 위하여 기록되었습니다.

숫자 2A는 t에 실험을 보여줍니다0: 점 현재로서는, 도파민은 적용되지 않으며 이렇게, D1 수용체는 자극되지 않습니다. 그 결과로, YFP 표를 붙인 D1 수용체는 세포 표면을 통해 균질에게 형광성에게 얼룩이 지기 제시하는 막 경계에 남아 있습니다. 형광성 배급에 있는 중요한 변경은 DA에 의해 D1 수용체의 자극에 달성됩니다. 숫자 2B는 T.에 기록된 심상의 전형적인 보기를 보여줍니다.10min 모든 DA 사격량을 위해, 아무 막 fl uorescence도 10 분 외피 후에 검출되지 않았습니다.

숫자 2. 상관 형광 화상 진찰 및 AFM는 측정을 강제합니다. AFM 끝은 DA 아날로그에 자유로운 DA를 적용하기 전후 YFP 표를 붙인 D1 수용체의 위치를 따르기 위하여 표를 붙였습니다. DA 에의한 자극의 앞에, 수용체는 세포 막 경계 이렇게이고, 형광은 세포 표면 (a) 전면 분산되고 군대 곡선은 특정 방면 사건 (c)의 높은 백분율을 전시합니다. DA 응용 후에 10 분, 모든 형광은 작은 점 (b)로 집중되고 아무 specifi c 사건도 모든 수용체가 cytosol로 내면화되었다는 것을 증명을 군대 양에서 기록되지 않습니다.

대신, 다중 작은 세포내 형광성 소포 가변 크기로 및 광도는 가능한 수용체 내면화 (숫자 2B)를 표시하는 관찰되었습니다. SH-SY5Y 세포에 있는 D1 수용체에 ligand DA의 액티브한 바인딩에 이 관측점은 만듭니다. 약한 형광이 필수 형광 심상을 장악하는 긴 노출 시간을 사용하는 저희를 신호한다는 것을 유의하십시오. 가능한 표백을 피하는 것은 DA의 응용 도중 우리를 닫고 형광 셔터를 열었습니다 심상을 취득하기의 바로 전에 초래합니다.

형광 화상 진찰 이외에, DA - D1 수용체 방면 군대는 도파민 존재 그리고 결핍에 있는 다른 시간 점에 생세포에 AFM 군대 양 최빈값을 사용하여 기록되었습니다. 시간 점 t (D1 수용체의 자극 없음)에 DA functionalized 끝을 가진0 단세포의 군대 양 화상 진찰은 특정 방면 사건 (숫자 2C)를 전시하는 군대 곡선의 signifi 캔트 부분 (13.12%) 귀착되었습니다.

평행으로 광학적인 관측에, 군대 측정은 또한 시간 점 t에 실행되었습니다10min (DA 에의한 D1 수용체의 자극 후에). 숫자 제 2에서 보이는 것처럼, 모든 기록한 군대 곡선은 아니 특정 방면 사건을 전시해, cytosol로 D1 수용체의 내면화의 형광 화상 진찰에 의하여 따라서 우리의 관측을 지원하. 우리는 DA 자극의 1 시간 후에도 뒤집을 수 있기 위하여 이 현상을 찾아내지 않았습니다. 심상과 시간 경과 영화의 비교는 형광 패턴의 관찰한 변경이 내면화 프로세스의 직접 결과이다는 것을 확인했습니다.

결과

우리의 연구 결과에서는, DA - 디디뮴 수용체 상호 작용은 223 ±의 주위에 82 pN 중심에 있던 단 하나 방면 군대를 전시했습니다. 흥미롭게, 비열한 피크값은 가장 강한 변이 및 높은 가치가 세포핵의 가까이에 취한 측정을 위해 관찰되었더라도 반면 세포의 가장자리에 측정될 때 안정되어 있었습니다. 지금까지, 도파민과 그것의 수용체 사이 상호 작용 기계장치는 완전히 이해되지 않습니다. 연구 결과는 그것의 잠재적인 수용체에 도파민의 약제 특성, 뿐 아니라 그것의 주작동근 및 길항근의 많은 것을, 보고합니다. 수용체 모형에 따라서, 분리 불변의 것은 880와 2980 nM 사이에서 있기 위하여 찾아냈습니다.

동적인 군대 분광학은 또한 활동적인 매개변수의 결심을 위해 사용될 수 있습니다. 우리의 작동 준비에서는, 모든 AFM 검사는 동일 조건 하에서 능력을 발휘했습니다, 그러나 스캐닝 매개변수를 변화하고 선적 비율의 기능으로 방면 군대를 음모를 꾸미는 것도 가능합니다. 곡선 진행성은 방면 프로세스의 활동이 에너지 조경의 안 외부 방벽 에 경우에 의지하고 있으면 여부 정보를 제공할 수 있습니다. 분리의 활동적인 떨어져 비율off 불변의 것 (k)는 또한 결의가 굳을 수 있습니다.

필수적으로에 의하여, 접착 군대를, 그러나 일정할 것이 상호 작용 시간 유지 및 진입 속도는 수축력 도중 선적 비율의 대수의 기능으로 음모를 꾸며서, 에너지 장벽의 길이 가늠자를 제시할 것입니다. 군대 0에 곡선의 Extraoplation는 K.를 줄 것입니다.off

다른 한편으로는 일정할 것이 접근 및 수축력 속도를 지키고 있는 동안, 상호 작용 시간의 기능으로 접착 주파수를 음모를 꾸미는 것은 필요할 것이 연결의 반 극대 확율을 위한 상호 작용 시간을 줄 것입니다. 마지막으로, 협회 비율 불변의 것 (k)를 알고 있on, 평형 불변의 것은 다음과 같이 결정될 수 있습니다: KD = K/Koffon.

결론

존재하는 수사는 살아있는 세포의 표면에 도파민 D1 수용체의 존재 그리고 바인드 재산을 공부하는 결합한 AFM와 형광 현미경 검사법의 잠재력을 설명합니다. neurodegenerative 질병의 연구 결과에 있는 AFM의 사용에 응용 주의 이 2 부분 시리즈에서 (AN117를 보십시오: I) 생명 공학 응용에서 사용된 2개의 중요한 기술의 통합에 집중된 실험을 분해하십시오. AFM와 광학적인 현미경 검사법 기술을 결합하는 것은 허용합니다:

  1. BF, DIC, 형광 및 AFM 고도 심상에 의하여 관심사의 분자의 3D 식별.
  2. 광학적인 화상 진찰 및 지형도 작성, 마찰, 점성과 탄성을 지니는, 및 접착 데이터를 통해 표적 분자의 유형 자산의 수사.
  3. 미크론 이하 가늠자에 셀 방식 신호 사건의 실시간 관측.
  4. ligand와 그것의 수용체 사이, 그리고 추가 넓이에 특정 방면 군대의 측정, 그들의 활동적인 매개변수의 결심. 이 마지막 선택권은 약학, 특히 약 발견의 필드에 있는 거대한 가능성을 엽니다.

AFM와 광학적인 현미경 검사법을 결합해서, 이것은 단 하나 실험에 있는 두 기술 전부의 이득을 뿐만 아니라 사용자에게 제공합니다, 또한 견본에 쉬운 접근 및 조작의 높은 융통성을 제안합니다. 우리는 이 연구 결과가 그 같은 multimodal 기계 사용의 가치에 관해서는 그럴듯하게 결과를 제공하고 신경학 연구에 있는 어드밴스를 속력을 낸다고 것을 도울 것이라고 믿습니다.

이 정보는 Bruker 계속 Nano 표면에 의해 제공된 물자에서 sourced, 검토해서 그리고 적응시켜 입니다.

이 근원에 추가 정보를 위해 Bruker Nano 표면을 방문하십시오.

Date Added: Jun 22, 2009 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:17

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