Het Bestuderen van de Interactie Tussen Dopamine en d1-Receptor in sh-SY5Y Cellen die de AtoomMicroscopie van de Kracht gebruiken

Besproken Onderwerpen

Inleiding
De Voorbereiding van de Steekproef
Het Gebruiken van AFM aan Dopamine van het Spoor de Verbindende D1 Receptoren van Binging
Resultaten
Conclusie

Inleiding

Naast zijn mogelijkheden van de hoge resolutieweergave, is de atoomkrachtmicroscopie (AFM) als krachtig hulpmiddel om zowel de nanomechanical eigenschappen als interactiekrachten van biomoleculaire complexen te meten te voorschijn gekomen. Terwijl de meerderheid van deze soorten studies AFM op geïsoleerde molecules is uitgevoerd, voor ware biologische relevantie zouden deze onderzoeken ideaal gezien op levende celsystemen moeten worden geleid.

Bovendien lijkt het nu essentieel AFM aan andere technieken zoals de optische microscopie kunnen koppelen om beide types van gegevens gelijktijdig te verzamelen. Tot dusver, zijn zeer weinig studies gebaseerd op de combinatie van AFM en de omgekeerde optische microscopie.

In de huidige studie onderzochten wij de potentiële toepassing van krachtmetingen in de controle van de reactie en het binden van eigenschappen van dopamine D1 receptor op stimulatie met dopamine. Wij gebruikten een volledig geïntegreerd systeem van AFM en van epifluorescence om fluorescentieweergave en AFM krachtmetingen te correleren.

Dopamine (DA, (2-aminoethyl) benzeen-1.2-diol 4) is een belangrijke neurotransmitter die die tot de catecholamine familie behoren, op een aromatisch aminozuur genoemd wordt gebaseerd tyrosine, en is de voorloper van twee belangrijke hormonen: adrenaline en noradrenalin.

In het perifere zenuwstelsel, de belangrijkste rol van dopamine is cardiovasculaire functies als analeptische, hormoonomzet, nierfunctie, vasculaire stroom en gastro-intestinale motiliteit te moduleren. In het centrale zenuwstelsel (CNS), is dopamine betrokken bij de controle van voortbewegingsfuncties, kennis, emotie, voedselopname en endocriene regelgeving. De Dysfunctie van dopaminergic neurotransmissie in CNS is verbonden met een verscheidenheid van neuropsychiatric wanorde, met inbegrip van het syndroom van Tourette, Ziekte van Parkinson, schizofrenie, paranoia, en de wanorde van de het tekorthyperactiviteit van de Aandacht (ADHD). Dopamine de receptoren zijn geclassificeerd van D1 aan D5 waarvan D1 en D2 de receptoren omhoog het grootste aandeel maken. Voor behandeling van deze ziekten is de identificatie van dopaminergic drugs verstoken van bijwerkingen één van de grootste uitdagingen in neuronenonderzoek en drugontdekking.

In deze bepaalde studie, gebruikten wij een YFP-Geëtiketteerde transmembraanD1 receptor om de specifistad van de interactie tussen deze receptor en een dopamine-modifi e-n uiteinde te onderzoeken AFM, gebruikend zowel de krachtspectroscopie als de optische weergaveeigenschappen van ons geïntegreerd hulpmiddel.

De Voorbereiding van de Steekproef

Sh-SY5Y de cellen waren transfected met YFP-Geëtiketteerde Dopamine D1 receptor (drd1-EYFP). De Transfectie werd uitgevoerd door nucleofection (Nucelofector, AMAXA) gebruikend een celopschorting (106 cells/ml), 4 µg plasmidenDNA, en 100 µl transfectiebuffer (AMAXA). Later, werden de cellen gezaaid op steriele dekkingsmisstappen (18x18 mm) in 6 goed platen. 48 h na transfectie adherente cellen die drd1-EYFP uitdrukken werden bevorderd met Dopamine 10-50 µM waterstofchloride.

Beelden (BF) van Brightfield, van DIC en van epifluorescence werden op een omgekeerde die microscoop van de Waarnemer van Zeiss Axio met een camera van AxioCam MRC en de software AxioVision wordt uitgerust verworven. Alle beelden AFM werden geregistreerd op een AFM die volledig met de optische microscoop is geïntegreerd, gebruikend cantilevers DNP/MSCT.

Alle experimenten werden uitgevoerd in contact en TappingMode™ gebruikend buffer PBS en zachtste van DNP- en de MSCT-Type cantilevers (nominale de lenteconstante 0.06 N/m en 0.01N/m, respectievelijk.). Cantilevers van Dopaminefunctionalized werden voorbereid zoals eerder beschreven.

Kortom, een polyethylene-glycol (PEG) derivaat, die een amino-reactief eind en een thiol-reactief eind hebben, werd gebruikt als linker en als inerte lling molecule achter-FI zodat slechts dopamine tot de waargenomen bindende interactie kon bijdragen. Constanten van de Lente werden berekend in vloeistof op een stijve steun (glasbodem van de Petrischaal) en de afbuigingsgevoeligheden werden manueel bijgewerkt in de software. Een totaal van 3072 krachtkrommen waren geregistreerde volumewijze van kracht, aan aftastentarief tussen 3 en 3.5 Herz, en met trekken vertraging van Mej. 10 in. Het aftastengebied was 2x2 µm.

Het Gebruiken van AFM aan Dopamine van het Spoor de Verbindende D1 Receptoren van Binging

Overexpressed YFP-Geëtiketteerde D1 receptoren lokaliseren hoofdzakelijk in het plasmamembraan en tonen een willekeurige distributie in neuronen sh-SY5Y cellen. Gebaseerd op fluorescentiegegevens eigen maken de receptoren zich in het cytoplasma op stimulatie met dopamine. om deze hypothese te steunen en de potentiële toepassing van AFM te testen, volgden wij band van de verbindende D1 receptoren van DA en hun verder intern maken.

Eerst, waren de cantilevers DNP functionalized met een dopamine analogon zoals die in Figuur 1 worden geïllustreerd. In de volgende stap werden de levende cellen blootgesteld aan verscheidene concentraties van DA van 10 tot 50 µM om de D1 membraanreceptoren te bevorderen.

Figuur 1. Het Bestuderen van ligand-receptorinteractie op een levende cel. Het uiteinde AFM is geweest functionalized zodanig dat de chemische delen van dopamine (DA) betrokken bij de interactie met zijn d1-Receptor worden bewaard. Bovendien minimaliseert de lengte van het verbindingsstuk het effect van het uiteinde op de interactie zelf.

Zowel werden de de epifluorescencebeelden als timelapse films geregistreerd om veranderingen in het fluorescente signaal van D1 receptordistributie te ontdekken en bijgevolg, het intern maken en de bindende eigenschappen van de YFP-Geëtiketteerde dopamine d1-Receptor te onderzoeken.

De Figuur 2A toont het experiment bij t0: op dit ogenblik is het punt, dopamine niet toegepast en zo, D1 de receptoren worden niet bevorderd. Dientengevolge, blijven de YFP-Geëtiketteerde D1 receptoren verbindend openbarend het homogene fluorescente bevlekken over de celoppervlakte. Een significante verandering in de fluorescente distributie wordt bereikt op stimulatie van de d1-Receptor door DA. Het Cijfer 2B toont een typisch die voorbeeld van de beelden bij t. worden geregistreerd.10min Voor alle concentraties van DA, werd geen uorescence van membraanFL ontdekt na 10 minuten incubatie.

Figuur 2. Correlerende fluorescentieweergave en AFM krachtmetingen. Het uiteinde AFM werd geëtiketteerd met een analogon van DA om de plaats van YFP-Geëtiketteerde d1-Receptoren te volgen before and after het toepassen van vrij DA. Vóór stimulatie door DA, zijn de receptoren verbindende cel en zo, wordt de fluorescentie verdeeld helemaal over de celoppervlakte (a) en de krachtkrommen stellen een hoog percentage specifieke losmakende gebeurtenissen (c) tentoon. 10 minuten na de toepassing van DA, is al fluorescentie geconcentreerd in kleine punten (b) en geen specific gebeurtenissen zijn geregistreerde volumetest van kracht dat alle receptoren in cytosol zijn geëigd.

In Plaats Daarvan, werden de veelvoudige kleine intracellular fluorescente blaasjesvariabele in grootte en de helderheid waargenomen wijzend op mogelijk receptorintern maken (Cijfer 2B). Deze observatie richt aan een actieve band van ligand DA aan de D1 receptor in het sh-SY5Y celmodel. Merk op dat de zwakke fluorescentiesignalen ons vereisten om lange blootstellingstijden te gebruiken om de fluorescentiebeelden te verkrijgen. om mogelijke blekengevolgen te vermijden sloten wij het fluorescentieblind tijdens de toepassing van DA en openden het vlak alvorens het beeld te verwerven.

Naast fluorescentieweergave, DA - de d1-Receptor losmakende krachten werden geregistreerd gebruikend De wijze van het afm- krachtvolume op levende cellen op verschillende tijdpunten in de aanwezigheid en de afwezigheid van dopamine. De het volumeweergave van de Kracht van single cell met a DA-Functionalized uiteinde op tijdpunt t0 (geen stimulatie van d1-Receptoren) resulteerde in een signifi afschuint gedeelte (13.12%) krachtkrommen tentoonstellend een specifieke losmakende gebeurtenis (Cijfer 2C).

Tegelijk met optische observaties, werden de krachtmetingen ook uitgevoerd op tijdpunt t10min (na stimulatie van d1-Receptoren door DA). Zoals aangetoond in Cijfer tweede, stelden alle geregistreerde krachtkrommen geen specifieke losmakende gebeurtenis tentoon, waarbij onze observaties worden gesteund door fluorescentieweergave van het intern maken van de d1-Receptoren in cytosol. Wij vonden omkeerbaar dit fenomeen niet om zelfs daarna 1 uur van de stimulatie van DA te zijn. De Vergelijking van beelden en tijd-tijdspanne films bevestigde dat de waargenomen verandering van fluorescentiepatroon een direct gevolg van het intern makenproces is.

Resultaten

In onze studies, DA - de Di-Receptor interactie stelden één enkele losmakende die kracht tentoon rond 223 ± 82 pN wordt gecentreerd. Interessant, was de gemiddelde piekwaarde stabiel wanneer gemeten bij de rand van de cel, terwijl de sterkste variaties en de hogere die waarden voor metingen waargenomen werden dichtbij de celkern worden genomen. Tot op heden, worden het interactiemechanisme tussen dopamine en zijn receptor niet volledig begrepen. De Studies melden de farmaceutische kenmerken van dopamine, evenals veel van zijn agonists en antagonisten, aan zijn potentiële receptoren. Afhankelijk van het receptortype, werden de scheidingsconstanten gevonden om tussen 880 en 2980 NM te zijn.

De Dynamische krachtspectroscopie kan ook voor bepaling van kinetische parameters worden gebruikt. In onze het werk opstelling, werd alle aftasten AFM uitgevoerd in de zelfde omstandigheden, maar het is ook mogelijk om de aftastenparameters te variëren en de losmakende kracht als functie van het ladingstarief in kaart te brengen. De vooruitgang van de Kromme kan informatie verstrekken over de vraag of als de kinetica van het losmakende proces afhankelijker is van de binnen of buitenbarrière van het energielandschap. Het kinetische van-tarief constant (k)off van scheiding kan ook worden bepaald.

Door hoofdzakelijk, in kaart brengend de adhesiekracht als functie van het logaritme van het ladingstarief tijdens het intrekken, terwijl het houden constant zullen de interactietijd en de benaderingssnelheid, de lengteschaal van de energiebarrière openbaren. Extraoplation van de kromme bij kracht nul zal K. geven.off

anderzijds, in kaart brengend de adhesiefrequentie als functie van de interactietijd terwijl het houden constant zullen de benadering en de intrekkensnelheid de interactietijd nodig voor helft-maximale waarschijnlijkheid van het binden geven. Tot Slot kennend het verenigingstarief constant (k)on, kan de evenwichtsconstante als volgt worden bepaald: KD = K/Koffon.

Conclusie

Het huidige onderzoek toont het potentieel van de gecombineerde microscopie van AFM en van de fluorescentie aan om de aanwezigheid en de bindende eigenschappen van dopamine d1-Receptoren op de oppervlakte van levende cellen te bestuderen. In deze reeks in twee delen Nota's van de Toepassing over het gebruik van AFM in de studie van neurodegenerative ziekten (Zie AN117: Deel I) experimenten concentreerde zich op de integratie van twee belangrijke die technieken in de toepassingen van de het levenswetenschap worden gebruikt. Het Combineren van optische de microscopietechnieken met AFM staat toe:

  1. 3D identificatie van molecules van belang door de beelden van BF, van DIC, van de fluorescentie en van de hoogte AFM.
  2. Onderzoek van de fysische eigenschappen van de doelmolecule door optische weergave en topografisch, wrijving, viscoelastic, en adhesiegegevens.
  3. echt - tijdobservatie van een cellulaire signalerende gebeurtenis bij de submicronschaal.
  4. Meting van de specifieke losmakende kracht tussen een ligand en zijn receptor, en in een verdere mate, bepaling van hun kinetische parameters. Deze laatste optie opent reusachtige mogelijkheden op het gebied van farmacologie, vooral drugontdekking.

Door de optische microscopie met AFM te combineren, voorziet dit niet alleen gebruikers van de voordelen van beide technieken in één enkel experiment, biedt het ook gemakkelijke toegang tot de steekproef en een hoge flexibiliteit van manipulatie aan. Wij geloven dat deze studies opleveren overtuigende resultaten in verband met de waarde van dergelijke multimodale instrumentatie en zullen helpen vooruitgang in neurologieonderzoek verzenden.

Deze informatie is afkomstig geweest, herzien en die van materialen door Bruker Nano Oppervlakten aangepast worden verstrekt.

Voor meer informatie over deze bron te bezoeken gelieve Nano Oppervlakten Bruker.

Date Added: Jun 22, 2009 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:07

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit