Estudando a Interacção Entre a Dopamina e o D1-Receptor em Pilhas de SH-SY5Y usando a Microscopia Atômica da Força

Assuntos Cobertos

Introdução
Preparação da Amostra
Usando o AFM Para Seguir os Receptors Binging do Membrana-Limite D1 da Dopamina
Resultados
Conclusão

Introdução

Além do que suas capacidades de alta resolução da imagem lactente, a microscopia atômica da força (AFM) emergiu como uma ferramenta poderosa para medir as propriedades nanomechanical e forças da interacção de complexos biomoleculares. Quando a maioria destes tipos de estudos do AFM for conduzida em moléculas isoladas, porque na importância biológica verdadeira estas investigações devem idealmente ser conduzidas em sistemas vivos da pilha.

Além, parece agora essencial poder acoplar o AFM com outras técnicas como a microscopia óptica a fim recolher simultaneamente ambos os tipos de dados. Até agora, poucos estudos são baseados muito na combinação de AFM e de microscopia óptica invertida.

No estudo actual nós investigamos a aplicação potencial de medidas da força em monitorar a resposta e as propriedades obrigatórias do receptor da dopamina D1 em cima da estimulação com dopamina. Nós usamos um sistema inteiramente integrado do AFM e do epifluorescence para correlacionar medidas da imagem lactente da fluorescência e da força do AFM.

A Dopamina (a DINAMARCA, 4 (2-aminoethyl) benzene-1,2-diol) é um neurotransmissor principal que pertence à família da catecolamina, com base em um ácido aminado aromático chamado tirosina, e é o precursor de duas hormonas principais: adrenalina e noradrenalin.

No sistema nervoso periférico, o papel principal da dopamina é modular funções cardiovasculares como um analeptic, um retorno da hormona, uma função renal, um fluxo vascular e uma mobilidade gastrintestinal. No sistema nervoso central (CNS), a dopamina é envolvida no controle de funções, da cognição, da emoção, da ingestão de alimentos e do regulamento locomotores da glândula endócrina. A Deficiência Orgânica da neurotransmissão dopaminergic no CNS é ligada a uma variedade de desordens neuropsiquiátricas, incluindo a síndrome de Tourette, a doença de Parkinson, a esquizofrenia, a paranóia, e do deficit de Atenção a desordem da hiperactividade (ADHD). Os receptors da Dopamina são classificados do D1 ao D5 de que os receptors D1 e D2 compo a proporção a maior. Para o tratamento destas doenças a identificação das drogas dopaminergic desprovidos dos efeitos secundários é um dos desafios os mais grandes na pesquisa e na descoberta neuronal da droga.

Neste estudo particular, nós usamos um receptor YFP-etiquetado da transmembrana D1 para investigar a cidade do specifi da interacção entre este receptor e uma ponta do AFM do ed da dopamina-modifi, usando a espectroscopia da força e as características ópticas da imagem lactente de nossa ferramenta integrada.

Preparação da Amostra

As pilhas de SH-SY5Y transfected com o receptor YFP-etiquetado da Dopamina D1 (DRD1-EYFP). O Transfection foi executado pelo nucleofection (Nucelofector, AMAXA) usando uma suspensão da pilha (106 cells/ml), o ADN de 4 plasmídeo do µg, e o amortecedor do transfection de 100 µl (AMAXA). Subseqüentemente, as pilhas foram semeadas nos enxertos estéreis da tampa (18x18 milímetro) em 6 placas boas. 48 h após as pilhas aderentes do transfection que expressam o DRD1-EYFP foram estimulados com hidrocloro da Dopamina do µM 10-50.

As imagens (BF) de Brightfield, de DIC e de epifluorescence foram adquiridas em um microscópio invertido do Observador de Zeiss Axio equipado com uma câmera de AxioCam MRC e o software de AxioVision. Todas As imagens do AFM foram gravadas em um AFM que fosse integrado inteiramente com o microscópio óptico, usando modilhões de DNP/MSCT.

Todas As experiências foram executadas no contacto e o TappingMode™ usando o amortecedor de PBS e o DNP- e o MSCT-tipo os mais macios modilhões (constante nominal 0,06 N/m e 0.01N/m da mola, respectivamente.). Os modilhões de Dopaminefunctionalized foram preparados como descrito anteriormente.

Momentaneamente, um derivado (PEG) do polietileno-glicol, tendo uma extremidade amino-reactiva e uma extremidade tiolato-reactiva, foi usado como um linker e como uma molécula para trás-fi lling inerte de modo que somente a dopamina pudesse contribuir às interacções obrigatórias observadas. As constantes da Mola foram calculadas no líquido em um apoio duro (parte inferior de vidro do prato de Petri) e as sensibilidades de deflexão eram manualmente actualizados no software. Um total de 3072 curvas da força foi gravado no modo do volume da força, em uma taxa de varredura entre 3 e 3,5 Hertz, e com um atraso do retraimanto da Senhora 10. A área da varredura era o µm 2x2.

Usando o AFM Para Seguir os Receptors Binging do Membrana-Limite D1 da Dopamina

Os receptors D1 YFP-etiquetados overexpressed localizam principalmente na membrana de plasma e mostram uma distribuição aleatória em pilhas neuronal de SH-SY5Y. Baseado em dados da fluorescência os receptors interiorizam no citoplasma em cima da estimulação com dopamina. A fim apoiar esta hipótese e testar a aplicação potencial do AFM, nós seguimos o emperramento dos receptors do membrana-limite D1 da DINAMARCA e de sua internalização subseqüente.

Primeiramente, os modilhões de DNP functionalized com um analog da dopamina como ilustrado em Figura 1. No passo seguinte as pilhas vivas foram expor a diversas concentrações da DINAMARCA de 10 ao µM 50 a fim estimular os receptors da membrana D1.

Figura 1. interacções de Estudo do ligante-receptor em uma pilha viva. A ponta do AFM functionalized de tal maneira que as partes químicas de dopamina (DA) envolvidas na interacção com seu D1-receptor são preservadas. Além, o comprimento do espaçador minimiza o efeito da ponta na interacção próprio.

As imagens do epifluorescence e os filmes do timelapse foram gravados para detectar mudanças no sinal fluorescente da distribuição do receptor D1 e conseqüentemente, investigar a internalização e as propriedades obrigatórias da dopamina YFP-etiquetada D1-receptor.

A Figura 2A mostra a experiência em t0: neste ponto do tempo, a dopamina não foi aplicada e assim, os receptors D1 não são estimulados. Em conseqüência, os receptors D1 YFP-etiquetados permanecem membrana-limite que revela uma mancha fluorescente homogênea através da superfície da pilha. Uma mudança significativa na distribuição fluorescente é conseguida em cima da estimulação do D1-receptor pela DINAMARCA. A Figura 2B mostra um exemplo típico das imagens gravadas no T.10min Para todas as concentrações da DINAMARCA, nenhum uorescence do fl da membrana foi detectado após uma incubação de 10 minutos.

A Figura 2. imagem lactente de Correlacionamento da fluorescência e AFM força medidas. A ponta do AFM foi etiquetada com um analog da DINAMARCA para seguir o lugar de D1-receptors YFP-etiquetado antes e depois de aplicar a DINAMARCA livre. Antes da estimulação pela DINAMARCA, os receptors são membrana-limite da pilha e assim, a fluorescência é distribuída por todo o lado na superfície da pilha (a) e as curvas da força exibem uma porcentagem alta dos eventos desatando-se específicos (c). 10 minutos após a aplicação da DINAMARCA, toda a fluorescência é concentrada nos pontos pequenos (b) e nenhum evento do specifi c é gravado no volume da força que mostra que todos os receptors estiveram interiorizados no cytosol.

Em Lugar De, a variável fluorescente intracelular pequena múltipla das vesículas em tamanho e o brilho foram observados indicar a internalização possível do receptor (Figura 2B). Os pontos dEsta observação a um emperramento activo da ligante a DINAMARCA ao receptor D1 na pilha de SH-SY5Y modelam. Note que a fluorescência fraca sinaliza exigido nos para usar tempos de exposição longos obter as imagens da fluorescência. A fim evitar o descoramento possível efectua-nos fechados o obturador da fluorescência durante a aplicação da DINAMARCA e aberta lhe imediatamente antes de adquirir a imagem.

Além do que a imagem lactente da fluorescência, a DINAMARCA - D1-receptor que desatam forças foram gravados usando o modo do volume da força do AFM em pilhas vivas em pontos diferentes do tempo na presença e na ausência de dopamina. A imagem lactente do volume da Força de uma única pilha com uma ponta a Dinamarca-functionalized no ponto t do tempo0 (nenhuma estimulação de D1-receptors) conduziu a uma parcela do cant do signifi (13,12%) de curvas da força que exibem um evento desatando-se específico (Figura 2C).

Paralelamente às observações ópticas, as medidas da força foram executadas igualmente no ponto t do tempo10min (após a estimulação de D1-receptors pela DINAMARCA). Segundo as indicações da Figura 2D, todas as curvas gravadas da força exibiram o evento desatando-se não específico, assim apoiando nossas observações pela imagem lactente da fluorescência da internalização do D1-receptors no cytosol. Nós não encontramos este fenômeno para ser reversíveis mesmo depois 1 hora da estimulação da DINAMARCA. A Comparação das imagens e dos filmes do tempo-lapso confirmou que a mudança observada do teste padrão da fluorescência é uma conseqüência directa do processo da internalização.

Resultados

Em nossos estudos, a DINAMARCA - as interacções do DI-receptor exibiram uma única força desatando-se centrada em torno 223 do ± 82 pN. Interessante, o valor máximo médio era estável quando medido na borda da pilha, visto que as variações as mais fortes e uns valores mais altos foram observados para as medidas tomadas perto do núcleo de pilha. Até agora, o mecanismo da interacção entre a dopamina e o seu receptor não é compreendido inteiramente. Os Estudos relatam as características farmacêuticas da dopamina, assim como muitas de seus agonistas e antagonistas, a seus receptors potenciais. Segundo o tipo do receptor, as constantes da dissociação foram encontradas para estar entre 880 e 2980 nanômetro.

A espectroscopia Dinâmica da força pode igualmente ser usada para a determinação de parâmetros cinéticos. Em nossa instalação de trabalho, todas as varreduras do AFM foram executadas sob as mesmas circunstâncias, mas é igualmente possível variar os parâmetros da exploração e traçar a força desatando-se em função da taxa de carregamento. A progressão da Curva pode fornecer a informação se se a cinética do processo se desatando é mais dependente da barreira interna ou exterior da paisagem da energia. A constante cinética da fora-taxa (K)off da dissociação pode igualmente ser determinado.

Por essencialmente, traçando a força da adesão em função do logarítmo da taxa de carregamento durante a retração, quando o mantimento constante o tempo de interacção e a velocidade de aproximação, revelarão a escala do comprimento da barreira de energia. Extraoplation da curva na força zero dará o K.off

por outro lado, traçar a freqüência da adesão em função do tempo de interacção ao manter constante a aproximação e a velocidade da retração dará o momento de interacção necessário para a probabilidade metade-máxima da ligação. Finalmente, conhecendo a constante da taxa da associação (K)on, a constante de equilíbrio pode ser determinado como segue: KD = K/Koffon.

Conclusão

A investigação actual demonstra o potencial da microscopia combinada do AFM e de fluorescência estudar a presença e as propriedades obrigatórias da dopamina D1-receptors na superfície de pilhas vivas. Nesta série bipartido de Notas de Aplicação no uso do AFM no estudo de doenças neurodegenerative (Veja AN117: Peça I) as experiências centradas sobre a integração de duas técnicas principais usadas em aplicações da ciência da vida. Combinar técnicas ópticas da microscopia com o AFM reserva:

  1. identificação 3D das moléculas do interesse FB, DIC, fluorescência e de altura do AFM por imagens.
  2. Investigação das propriedades físicas da molécula do alvo com a imagem lactente óptica e os dados topográficos, da fricção, os viscoelastic, e da adesão.
  3. observação do tempo real de um evento celular da sinalização na escala submicrónica.
  4. Medida da força desatando-se específica entre uma ligante e seu receptor, e a uma extensão mais adicional, determinação de seus parâmetros cinéticos. Esta última opção abre possibilidades enormes no campo da farmacologia, especialmente descoberta da droga.

Combinando a microscopia óptica com o AFM, isto fornece não somente usuários os benefícios de ambas as técnicas em uma única experiência, igualmente oferece o acesso fácil à amostra e uma flexibilidade alta da manipulação. Nós acreditamos que estes estudos fornecem resultados de forma convincente a respeito do valor de tal instrumentação multimodal e os ajudarão a apressar avanços na pesquisa da neurologia.

Esta informação foi originária, revista e adaptada dos materiais fornecidos por Superfícies Nano de Bruker.

Para obter mais informações sobre desta fonte visite por favor Superfícies Nano de Bruker.

Date Added: Jun 22, 2009 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:25

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit