Изучать Взаимодействие Между Допамином и D1-Receptor в Клетках SH-SY5Y используя Атомную Микроскопию Усилия

Покрытые Темы

Введение
Подготовка Образца
Используя AFM для того чтобы Отслеживать Приемные Устройства Мембран-Предела D1 Допамина Binging
Результаты
Заключение

Введение

В дополнение к своим высоким возможностям воображения разрешения, атомная микроскопия усилия (AFM) вытекла как мощный инструмент для измерять и nanomechanical свойства и усилия взаимодействия биомолекулярных комплексов. Пока большинство этих типов изучений AFM было дирижировано на изолированных молекулах, ибо истинной биологической релевантности эти исследования должны идеально быть дирижированы на системах в реальном маштабе времени клетки.

В добавлении, теперь кажется необходимо мочь соединить AFM с другими методами как оптически микроскопия одновременно для того чтобы собрать оба типа данных. До тех пор, очень немногие изучения основаны на сочетание из AFM и перевернутой оптически микроскопии.

В текущем исследовании мы расследовали потенциальные измерения приложения силы в контролировать реакцию и binding свойства приемного устройства допамина D1 на стимулировании с допамином. Мы использовали польностью интегрированную систему AFM и epifluorescence для того чтобы сопоставить измерения воображения флуоресцирования и усилия AFM.

Допамин (DA, 4 (2-aminoethyl) benzene-1,2-diol) главный нейротрансмиттер принадлежа к семейству катехоламина, основанному на ароматичной вызванной аминокислоте тирозином, и прекурсор 2 главных инкретей: adrenalin и noradrenalin.

В периферийной слабонервной системе, главным образом роль допамина модулировать сердечнососудистые функции как аналептик, оборачиваемость инкрети, ренальная функция, васкулярная подача и желудочно-кишечный motility. В центральной системе (CNS), допамин включается в управление локомоторных функций, познавательности, взволнованности, входа еды и регулировки эндокрина. Дисфункция допаминэргического neurotransmission в CNS соединена к разнообразие neuropsychiatric разладам, включая синдром Tourette, заболевание Parkinson, шизофрению, паранойю, и дефицит Внимания разлад hyperactivity (ADHD). Приемные устройства Допамина расклассифицированы от D1 к D5 чего приемные устройства D1 и D2 составляют самую большую пропорцию. Для обработки этих заболеваний идентификация допаминэргических снадобиь лишенных побочных эффектов одна из самых больших возможностей в нейрональных исследовании и открытии снадобья.

В этом определенном изучении, мы использовали YFP-обозначенное приемное устройство transmembrane D1 для того чтобы расследовать город specifi взаимодействия между этим приемным устройством и подсказкой AFM ed допамина-modifi, используя и спектроскопию усилия и оптически характеристики воображения нашего интегрированного инструмента.

Подготовка Образца

Клетки SH-SY5Y были transfected с YFP-маркированным приемным устройством Допамина D1 (DRD1-EYFP). Transfection был выполнен nucleofection (Nucelofector, AMAXA) используя подвес клетки (106 cells/ml), ДНА 4 плазмид µg, и буфер transfection 100 µl (AMAXA). Затем, клетки были осеменены на стерильных выскальзованиях крышки (18x18 mm) в 6 хороших плитах. 48 h после клеток transfection адэрентных выражая DRD1-EYFP были простимулированы с хлоргидратом Допамина µM 10-50.

Изображения (BF) Brightfield, DIC и epifluorescence были приобретены на микроскопе Наблюдателя Zeiss Axio перевернутом оборудованном с камерой AxioCam MRC и ПО AxioVision. Все изображения AFM были записаны на AFM который полно был интегрирован с оптически микроскопом, используя cantilevers DNP/MSCT.

Все эксперименты были выполнены в контакте и TappingMode™ используя буфер PBS и самые мягкие DNP- и MSCT-тип cantilevers (номинальную константу 0,06 N/m и 0.01N/m весны, соответственно.). Cantilevers Dopaminefunctionalized были подготовлены как ранее описано.

Кратко, производный (PEG) полиэтиленгликоля, имеющ амино-реактивный конец и тиол-реактивный конец, было использовано как линкер и как инертная lling молекула назад-fi так как только допамин смог внести вклад в наблюдаемые binding взаимодействия. Константы Весны были высчитаны в жидкости на жесткой поддержке (стеклянном дне Чашка Петри) и чувствительности по отклонению были вручную обновленный в ПО. Итог 3072 кривых усилия был записан в режиме тома усилия, на частоте сканирования между 3 и 3,5 Hz, и с задержкой втягивать Мс 10. Зона развертки было µm 2x2.

Используя AFM для того чтобы Отслеживать Приемные Устройства Мембран-Предела D1 Допамина Binging

Overexpressed YFP-маркированные приемные устройства D1 локализуют главным образом в мембране плазмы и показывают случайное распределение в нейрональных клетках SH-SY5Y. Основано на данных по флуоресцирования приемные устройства внедряют в цитоплазму на стимулировании с допамином. Для того чтобы поддержать это предположение и испытать потенциальное применение AFM, мы отслеживали вязку приемных устройств мембран-предела D1 DA и их последующего internalization.

Во-первых, cantilevers DNP были functionalized с аналогом допамина как иллюстрировано в Диаграммой 1. В следующем шаге клетки в реальном маштабе времени подверглись действию к нескольк концентрации DA от 10 к µM 50 для того чтобы простимулировать приемные устройства мембраны D1.

Диаграмма 1. Изучая взаимодействия лиганд-приемного устройства на живущей клетке. Подсказка AFM была functionalized в такой манере это сохранены химические moieties допамина, котор включили в взаимодействие с своим D1-receptor. В добавлении, длина прокладки уменьшает влияние самого подсказки на взаимодействии.

И были записаны, что обнаружили изображения epifluorescence и кино timelapse изменения в дневном сигнале распределения приемного устройства D1 и следовательно, расследовать internalization и binding свойства YFP-маркированного допамина D1-receptor.

На Диаграмму 2A показано эксперимент на t0: в это время укажите, допамин не прикладной и таким образом, не простимулированы приемные устройства D1. В результате, YFP-маркированные приемные устройства D1 остают мембран-пределом показывая однотиповый дневной пятнать через поверхность клетки. Значительно изменение в дневном распределении достигано на стимулировании D1-receptor DA. На Диаграмму 2B показано типичный пример изображений записанных на T.10min Для всей концентрации DA, никакое uorescence fl мембраны не было обнаружено после инкубации 10 минут.

Диаграмма 2. Сопоставляя воображение флуоресцирования и AFM принуждает измерения. Подсказка AFM была маркирована с аналогом DA для следования положения YFP-маркированного D1-receptors перед и после прикладывать свободный DA. Перед стимулированием DA, приемные устройства мембран-предел клетки и таким образом, флуоресцирование распределено на всем поверхность клетки (A) и кривые усилия показывают высокий процент специфических unbinding случаев (C). 10 минут после применения DA, все флуоресцирование сконцентрировано в малые многоточия (B) и никакие случаи c specifi не записаны в томе усилия доказывая что все приемные устройства были внедрены в cytosol.

Вместо, множественные малые внутриклеточные дневные vesicles переменные в размере и яркости наблюдались показать возможный internalization приемного устройства (Диаграмму 2B). Эти места наблюдения к активной вязке лиганда DA к приемному устройству D1 в клетке SH-SY5Y моделируют. Заметьте что слабое флуоресцирование сигнализирует необходимо нас для использования времен долгой выдержки получить изображения флуоресцирования. Во избежании возможный bleaching производит эффект мы закрыло штарку флуоресцирования во время применения DA и раскрыло его только перед приобретать изображение.

В дополнение к воображению флуоресцирования, DA - усилия D1-receptor unbinding были записаны используя режим тома усилия AFM на живущих клетках на различные этапы времени в присутсвии и отсутствии допамина. Воображение тома Усилия single cell с подсказкой DA-functionalized на этап t времени0 (отсутствие стимулирования D1-receptors) привело к в части cant signifi (13,12%) кривых усилия показывая специфический unbinding случай (Диаграмму 2C).

В параллели к оптически замечаниям, измерения усилия также были выполнены на этап t времени10min (после стимулирования D1-receptors DA). Как показано в Диаграмме 2D, все записанные кривые усилия показали не специфический unbinding случай, таким образом поддерживающ наши замечания воображением флуоресцирования internalization D1-receptors в cytosol. Мы не нашли это явление для того чтобы быть реверзибельны даже после 1 часа стимулирования DA. Сравнение изображений и кино врем-упущения подтвердило что наблюдаемое изменение картины флуоресцирования прямое следствие процесса internalization.

Результаты

В наших изучениях, DA - взаимодействия DI-приемного устройства показали одиночное unbinding усилие сконцентрированное 223 ± 82 pN. Интересно, максимальное значение было стабилизировано измеряно на крае клетки, тогда как самые сильные изменения и более высокие значения наблюдались для измерений принятых около клеточного ядра. Датирует, механизм взаимодействия между допамином и своим приемным устройством полно не поняты, что. Изучения сообщают фармацевтические характеристики допамина, так же, как много из своих агонистов и антагонистов, к своим потенциальным приемным устройствам. В зависимости от типа приемного устройства, были найдены, что находились постоянные диссоциации между 880 и 2980 nM.

Спектроскопию Динамического усилия можно также использовать для определения кинетических параметров. В нашем работая настроении, все развертки AFM были выполнены в тех же условиях, но также возможно поменять параметры скеннирования и проложить курс unbinding усилие как функция тарифа нагрузки. Прогрессирование Кривого может обеспечить информацию о ли если кинетика unbinding процесса зависел на внутреннем или наружном барьере ландшафта энергии. Кинетическая константа -тарифа (Koff) разобщенности может также быть решительно.

существенно, прокладывающ курс усилия прилипания как функция логарифма тарифа нагрузки во время стягивания, пока держать постоянн время взаимодействия и скорость захода на посадку, покажут маштаб длины энергетического барьера. Extraoplation кривого на усилии нул передаст K.off

с другой стороны, прокладка курса частоты прилипания как функция времени взаимодействия пока держащ постоянн подход и скорость стягивания передаст время взаимодействия необходимое для половин-maximal вероятности связывать. Окончательно, знающ константу тарифа ассоциации (Kon), константу равновесия можно определить что следующим образом: KD = K/Koffon.

Заключение

Присутствующее исследование демонстрирует потенциал совмещенной микроскопии AFM и флуоресцирования изучить присутсвие и binding свойства допамина D1-receptors на поверхности клеток в реальном маштабе времени. В этой двухраздельной серии Примечаний по Применению на пользе AFM в изучении neurodegenerative заболеваний (См. AN117: Разделите эксперименты по I) сфокусированные на внедрении 2 главных методов используемых в применениях наук о жизни. Совмещать оптически методы микроскопии с AFM позволяет:

  1. идентификация 3D молекул интереса BF, DIC, флуоресцированием и высотой AFM изображениями.
  2. Исследование физических свойств молекулы цели через оптически воображение и данные по топографических, трения, вязко-эластических, и прилипания.
  3. в реальном масштабе времени замечание клетчатого случая signaling на маштабе субмикрона.
  4. Измерение специфического unbinding усилия между лигандом и своим приемным устройством, и в более последующий объем, определение их кинетических параметров. Этот последний вариант раскрывает огромные возможности в поле лекарствоведения, специально открытия снадобья.

Путем совмещать оптически микроскопию с AFM, это не только обеспечивает пользователей с преимуществами обоих методов в одиночном эксперименте, оно также предлагает легкий доступ к образцу и высокую гибкость манипуляции. Мы верим что эти изучения обеспечивают convincing результаты о значении такого multimodal измерительного оборудования и помогут быстро пройти выдвижения в исследование неврологии.

Эта информация найденный, расмотрена и приспособлена от материалов обеспеченных Поверхностями Bruker Nano.

Для больше информации на этом источнике пожалуйста посетите Поверхности Bruker Nano.

Date Added: Jun 22, 2009 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:27

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit