Studera Växelverkan Mellan Dopamine och D1-Receptor i SH--SY5YCeller genom att använda Atom- StyrkaMicroscopy

Täckte Ämnen

Inledning
Ta Prov Förberedelsen
Använda AFM för att Spåra Binging Membran-Destinerade Receptors D1 för Dopamine
Resultat
Avslutning

Inledning

Förutom dess kickupplösning som avbildar kapaciteter, har atom- styrkamicroscopy, (AFM) dykt upp som ett kraftigt bearbetar för att mäta den båda nanomechanical rekvisitan och växelverkanstyrkorna av biomolecular komplex. Fördriva majoriteten av dessa typer av AFM-studier har förats på isolerade molekylar, for riktig biologisk relevans dessa utredningar bör idealt föras på levande cellsystem.

I tillägg verkar det nu nödvändigt att vara kompetent att koppla ihop AFM med annan optisk microscopy för tekniknågot liknande för att samtidigt mot efterkrav båda typer av data. Så långt, baseras mycket få studier på kombinationen av AFM och inverterad optisk microscopy.

I den närvarande studien utforskade vi den potentiella applikationen av styrkamätningar, i att övervaka svar och bandrekvisitan av receptoren för dopamine D1 på stimulans med dopamine. Vi använde ett fullständigt inbyggt AFM- och epifluorescencesystem för att korrelera avbilda och AFM-styrkamätningar för fluorescence.

Dopamine (DA, 4 (2-aminoethyl) benzene-1,2-diol) är en ha som huvudämneneurotransmitter som hör hemma till catecholaminefamiljen som baseras på en aromatisk amino-syra som kallas tyrosine och är precursoren av två huvudsakliga hormon: adrenalin och noradrenalin.

I kringutrustningnervsystemet är den huvudsakliga rollen av dopamine att modulera kardiovaskulärt fungerar som en analeptic, hormonomsättningen som är renal fungerar, kärl- flöde och gastrointestinal motilitet. I centrala nervsystemet (CNS) är dopamine involverad i kontrollera av locomotor fungerar, kognition, sinnesrörelse, matintag och endocrineregleringen. Dysfunction av dopaminergic neurotransmission i CNSEN anknytas till en variation av neuropsychiatric oordningar, inklusive Tourettes syndrom, Parkinsons sjukdom, schizofreni, paranoia och oordning för Uppmärksamhetunderskotthyperactivity (ADHD). Dopaminereceptors klassificeras från D1 till D5 som sminket för receptors D1 och D2 det störst proportionerar av. För behandling av dessa sjukdomar är IDet av dopaminergic droger som är devoid av biverkningar, en av de största utmaningarna i neuronal forskning och drogupptäckt.

I denna särskilda studie, använde vi enmärkt receptor för transmembrane D1 för att utforska specifistaden av växelverkan mellan denna receptor och en spets för dopamine-modifiedAFM, genom att använda både styrkaspektroskopin och de optiska avbilda särdragen av vårt inbyggt bearbeta.

Ta Prov Förberedelsen

SH--SY5Yceller transfected med denmärkte receptoren för Dopamine D1 (DRD1-EYFP). Transfectionen utfördes av nucleofectionen (Nucelofector, AMAXA) som använder en cellupphängning (106 cells/ml), DNA för 4 µgplasmids, och transfectionen för 100 µl fungera som buffert (AMAXA). Därpå kärnades ur celler på sterilt täcker snedsteg (en mm 18x18) i 6 som brunnen pläterar. H 48 efter fastsittande celler för transfectionen som uttrycker DRD1EN-EYFP, stimulerades med Dopaminehydrochloride för µM 10-50.

Brightfield (BF), DIC och epifluorescencen avbildar ficks på ett inverterat mikroskop för den Zeiss Axio Observatören som utrustas med en AxioCam MRC kamera och den AxioVision programvaran. All AFM avbildar antecknades på en AFM, som har fullständigt integrerats med det optiska mikroskopet, genom att använda DNP-/MSCTcantilevers.

Alla experiment utfördes i kontakt, och TappingMode™ som använder PBS, fungera som buffert och de mest mjuka DNP-- och MSCT-typ cantileversna (nominalen fjädrar konstant 0,06 N/m och 0.01N/m, respektive.). Dopaminefunctionalized cantilevers var förberedda som föregående beskrivit.

Kort avslutar (PEG) englykol derivata och att ha ettreactive, och ettreactive avslutar, användes som en linker och som en inert lling molekyl baksida-fi, så att endast dopamine kunde bidra till observerade bindande växelverkan. Fjädra konstanter beräknades i vätska på en styv service (exponeringsglasbotten av den Petri maträtten), och avböjningskänsligheter uppdaterades manuellt i programvaran. En slutsumma av 3072 som styrka buktar, antecknades i styrkavolymfunktionsläge, på bildläsningen klassar mellan 3 och 3,5 Hertz och med en tillbakadragningsfördröjning av ms 10. Bildläsningsområdet var µm 2x2.

Använda AFM för att Spåra Binging Membran-Destinerade Receptors D1 för Dopamine

De overexpressed YFP-märkte receptorsna D1 lokaliserar främst i plasmamembranet och visar en slumpmässig fördelning i neuronal SH--SY5Yceller. Baserat på fluorescencedata internaliserar receptorsna in i cytoplasmen på stimulans med dopamine. För att stötta denna hypotes och för att testa den potentiella applikationen av AFM, spårade vi bandet av membran-destinerade receptors D1 för DA och deras följande internalisering.

Först functionalized DNP-cantilevers med en dopaminemotsvarighet, som illustrerat in Figurera 1. I det nästa kliva levande celler var utsatt till flera DA-koncentrationer från 10 till µM 50 för att stimulera receptorsna för membranet D1.

Figurera 1. Studera ligand-receptor växelverkan på en bosatt cell. AFM-spetsen har varit functionalized in sådan långt som de kemiska hälfterna av dopamine som (DA) är involverade i växelverkan med dess D1-receptor, bevaras. I tillägg minimerar längden av avståndsmätaren verkställa av spetsen på växelverkan sig själv.

Både epifluorescencen avbildar, och timelapsefilmer antecknades för att avkänna ändringar i det fluorescerande för att signalera av fördelning för receptor D1 och därför, för att utforska internalisering- och bandrekvisitan av denmärkte dopaminen D1-receptor.

Figurera shows 2A experiment på t0: på denna tid peka, har dopaminen inte applicerats, och thus, stimuleras receptors D1 inte. Som ett resultat återstår demärkte receptorsna D1 membran-destinerade avslöja homogent fluorescerande befläcka över cellen ytbehandlar. En viktig ändring i den fluorescerande fördelningen uppnås på stimulansen av D1en-receptor av DA. Figurera shows 2B som ett typisk exempel av avbildar antecknat på t10min. För alla DA-koncentrationer avkändes ingen membranfl-uorescence, efter 10 har noterat inkubation.

Figurera 2. Korrelera avbilda och AFM-styrkamätningar för fluorescence. AFM-spetsen märktes med en DA-motsvarighet för att följa läget av YFP-märkt D1-receptors, innan och når du har applicerat fri DA. För stimulans av DA är receptors dendestinerade cellen och thus, är fluorescence utdelad alla över cellen ytbehandlar (A), och styrka buktar utställningen per kickprocentsats av unbinding händelser för närmare detalj (C). 10 noterar efter DA-applikation, koncentreras alla fluorescence in i litet pricker (B), och inga händelser för specifi c antecknas i styrkavolym som bevisar att alla receptors har internaliserats in i cytosolen.

I stället storleksanpassar den små intracellular fluorescerande vesiclesvariabeln för multipeln in, och ljusstyrka observerades att indikera möjlighetreceptorinternalisering (Figurera 2B). Denna observation pekar till ett aktivband av liganden DA till receptoren D1 i SH--SY5Ycellen modellerar. Notera att svag fluorescence signalerar krävt oss för att använda långa exponeringstider att erhålla fluorescencen avbildar. För att att undvika att bleka för möjlighet verkställer oss stängde fluorescencen stänger med fönsterluckor under applikationen av DA och som precis öppnar det, innan det får avbilda.

Förutom fluorescence som avbildar, DA - antecknades unbinding styrkor för D1-receptor genom att använda funktionsläge för AFM-styrkavolym på bosatt celler på olik tid pekar i närvaroen och frånvaroen av dopamine. Att avbilda för Styrkavolym av en singelcell med en DA-functionalized som spetsen på tid pekar t0 (ingen stimulans av D1-receptors) resulterade i en significant portionr (13,12%) av styrka buktar ställa ut en specifik unbinding händelse (Figurera 2C).

I parallell till optiska observationer utfördes styrkamätningarna också på tid pekar t10min (efter stimulans av D1-receptors av DA). Som visat in Figurera 2D, all antecknad styrka buktar ställde ut ingen specifik unbinding händelse, således understödja våra observationer, genom att avbilda för fluorescence av internaliseringen av D1en-receptors in i cytosolen. Vi fann inte detta fenomen för att vara vändbara även efter 1 timme av DA-stimulansen. Jämförelsen av avbildar, och Time-schackningsperiod filmer bekräftade att den observerade ändringen av fluorescence mönstrar är en riktaföljd av den processaa internaliseringen.

Resultat

I våra studier DA - DI-receptor växelverkan ställde ut en unbinding styrka för singel som centrerades runt om 223 ± 82 pN. Interestingly värderar det genomsnittliga maximalt var stabilt, när det mätas på kanta av cellen, eftersom starkast variationer och värderar higher observerades för mätningar som tas nära cellnucleusen. Hitintills förstås växelverkanmekanismen mellan dopamine och dess receptor inte fullständigt. Studier anmäler de farmaceutiska kännetecknen av dopamine såväl som många av dess agonists och antagonists, till dess potentiella receptors. Beroende av receptortypen fanns dissociationkonstanterna för att vara mellan 880 och 2980 nM.

Den Dynamiska styrkaspektroskopin kan också användas för beslutsamhet av kinetic parametrar. I vårt arbete ställa in, utfördes alla AFM-bildläsningar under samma villkorar, men det är också möjligheten som varierar scanningparametrarna och som konspirerar den unbinding styrkan, som en fungera av ladda klassar. Bukta fortgången kan ge information om huruvida, om kinetics av den processaa unbindingen är mer anhörig på det inre, eller den yttre barriären av energin landskap. De kinetic av-klassar konstant (Koff) av dissociation kan också vara beslutsamma.

Vid i grunden och att konspirera adhesionstyrkan som en fungera av logaritmen av ladda klassa under tillbakadragningen, fördriver hålla konstant växelverkantiden, och att närma sig rusar, ska avslöjer längdfjäll av energibarriären. Extraoplation av bukta på ska styrka nolla ger K.off

Å andra sidan och att konspirera adhesionfrekvensen som en fungera av växelverkantidstunderna som håller konstant rusar att närma sig och tillbakadragningen, ska ger växelverkantiden som behövs för halva-maximal probability av bandet. Slutligen och att veta anslutningen klassa konstant (Kon), equilibriumkonstanten kan vara beslutsamt som följer: KD = K/Koffon.

Avslutning

Den närvarande utredningen visar det potentiellt av kombinerad AFM och fluorescencemicroscopy till studien närvaro och bandrekvisitan av dopamine D1-receptors på ytbehandla av levande celler. I denna två-del Noterar serien av Applikationen på bruket av AFM i studien av neurodegenerative sjukdomar (Se AN117: Delen ha som huvudämne Jag) experiment fokuserade på integrationen av två tekniker som används i vetenskaperna om olika organismers beskaffenhetapplikationer. Kombination av optiska microscopytekniker med AFM låter:

  1. ID 3D av molekylar av intresserar vid BF, DIC, fluorescence, och AFM-höjd avbildar.
  2. Utredning av läkarundersökningrekvisitan av uppsätta som målmolekylen till och med optiskt avbilda och topographic, för friktion, viscoelastic och adhesiondata.
  3. realtidsobservation av en cell- signalerandehändelse på submicronfjäll.
  4. Mätning av den specifika unbinding styrkan mellan en ligand och dess receptor och till en mer ytterligare grad, beslutsamhet av deras kinetic parametrar. Detta sist alternativ öppnar enorma möjligheter i sätta in av pharmacology, speciellt drogupptäckt.

Genom att kombinera optisk microscopy med AFM ger detta inte endast användare med gynnar av båda tekniker i ett singelexperiment, erbjuder den också lätt tar fram till ta prov och en kickböjlighet av behandlig. Vi tror att dessa studier ger övertygande resultat om värdera av sådan multimodal instrumentation och ska hjälp rusar framflyttningar i neurologyforskning.

Denna information har varit sourced, granskat, och anpassat från material förutsatt att av Nano Bruker Ytbehandlar.

För mer information på denna källa behaga besök Nano Bruker Ytbehandlar.

Date Added: Jun 22, 2009 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:31

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit