学习多巴胺和 D1 感受器官之间的交往在使用基本强制显微学的 SH-SY5Y 细胞

包括的事宜

简介
范例准备
使用跟踪的 AFM 狂欢对膜 D1 感受器官的多巴胺
结果
结论

简介

除其高分辨率想象功能之外,基本强制显微学 (AFM)涌现了作为为评定 nanomechanical 属性和生物化子的复杂交往强制的一个强大的工具。 当大部分 AFM 研究的这些类型在查出的分子,为了真的生物相关性时执行在活细胞系统应该理想地说进行这些调查。

另外,能耦合与其他技术的 AFM 象光学显微学为了同时收集数据的两个类型现在看上去重要。 到目前为止,非常少量研究在 AFM 和被倒置的光学显微学基础上的组合。

在本研究中我们调查强制评定的潜在的应用在监控多巴胺 D1 感受器官回应和黏合性的在与多巴胺的刺激。 我们使用一个充分地集成 AFM 和 epifluorescence 系统关联荧光想象和 AFM 强制评定。

多巴胺 (DA, 4 (2 氨基) 苯 1,2 二醇) 是属于儿茶酚胺系列的一个主要神经传送体,根据称酚基乙氨酸的芳香氨基酸,并且是二种主要激素前体: 肾上腺素和 noradrenalin。

在周围神经系统,多巴胺的主要角色是调整心血管功能作为强壮剂、激素销售量、肾脏功能、血管流和食道能动性。 在这个中央神经系统 (CNS),多巴胺在运动的功能、认知、情感、摄食和内分泌管理规定控制介入。 多巴胺能的神经传递的官能不良在 CNS 的与各种各样神经精神病学的紊乱被链接,包括 Tourette 的综合症状、帕金森病、精神分裂症、偏执狂和注意力不集中活动过度紊乱 (ADHD)。 多巴胺感受器官从 D1 被分类到 D1 和 D2 感受器官组成最大的比例的 D5。 对于这些疾病的处理多巴胺能的药物的确定无副作用是其中一在神经细胞的研究和药物发现的大挑战。

使用强制分光学和我们的集成工具,光学想象功能在此特殊研究中,我们使用一种 YFP 被标记的横跨膜 D1 感受器官调查此感受器官和多巴胺modifi 编辑 AFM 技巧之间的交往 specifi 城市。

范例准备

SH-SY5Y 细胞 transfected 与 YFP 标记的多巴胺 D1 感受器官 (DRD1-EYFP)。 转染由 nucleofection (Nucelofector, AMAXA) 执行使用细胞暂挂 (10 个6 cells/ml), 4 µg 质粒脱氧核糖核酸和 100 µl 转染缓冲 (AMAXA)。 随后,细胞是种子在不育的盖子清单 (18x18 mm) 在 6-well 牌照。 48 h 在表示转染依附的细胞以后 DRD1-EYFP 刺激了与 10-50 µM 多巴胺氯化物。

Brightfield (BF)、 DIC 和 epifluorescence 图象在用 AxioCam MRC 照相机和 AxioVision 软件装备的蔡司 Axio 观察员倒置显微镜获取了。 使用 DNP/MSCT 悬臂,所有 AFM 图象在充分地集成与光学显微镜的 AFM 被记录了。

使用 PBS 缓冲和最软的 DNP- 和 MSCT 型的悬臂 (名义上的弹簧常数 0.06 N/m 和 0.01N/m,所有实验在联络TappingMode™执行,分别。)。 Dopaminefunctionalized 悬臂如前所述准备。

简而言之,聚乙二醇 (PEG)衍生商品,有一个氨基易反应的末端和一个硫烃易反应的末端,使用了作为连接器和作为一个惰性后面 fi lling 的分子,以便仅多巴胺能造成被观察的约束交往。 弹簧常数在僵硬的技术支持 (培养皿的玻璃底层的流体被计算了),并且偏转灵敏度在这个软件手动地被更新了。 总共 3072 强制曲线记录了生效数量模式,以在 3 和 3.5 Hz 之间的扫瞄速率和与 10 女士缩回延迟。 扫描区是 2x2 µm。

使用跟踪的 AFM 狂欢对膜 D1 感受器官的多巴胺

overexpressed YFP 标记的 D1 感受器官主要在质膜在神经细胞的 SH-SY5Y 细胞局限化并且显示一个任意配电器。 基于荧光数据感受器官向内到细胞质在与多巴胺的刺激。 为了支持此假说和测试 AFM 的潜在的应用,我们跟踪 DA 的捆绑对膜 D1 感受器官和他们随后的内在化。

首先, DNP 悬臂 functionalized 以多巴胺类似物如图 1. 所示。 在下一个步骤活细胞显示在从 10 的几 DA 浓度到 50 µM 为了刺激 D1 膜感受器官。

在一个活细胞的图 1. 学习的配合基感受器官交往。 AFM 技巧 functionalized,在这种情况下在交往多巴胺 (DA)介入的化工份额与其 D1 感受器官保留。 另外,这个间隔号的长度使这个技巧的作用对交往减到最小。

Epifluorescence 图象和 timelapse 电影被记录检测在 D1 感受器官配电器上萤光信号的变化和因而,调查 YFP 标记的多巴胺 D1 感受器官的内在化和黏合性。

图 2A 显示这个实验在 t0 : 此时点,未应用多巴胺,并且因而, D1 感受器官没有被刺激。 结果, YFP 标记的 D1 感受器官保持膜显示一同类萤光弄脏在细胞表面间。 在萤光配电器上的一个重大的变化达到在 D1 感受器官的刺激由 DA。 图 2B 显示图象的一个典型的示例被记录在 T。10min 对于所有 DA 浓度,膜 fl uorescence 未在 10 分钟孵出以后被检测。

图 2. 关联的荧光想象和 AFM 强制评定。 在应用自由的 DA 前后, AFM 技巧标记以 DA 类似物按照 YFP 标记的 D1 感受器官的地点。 在 DA 的刺激前,感受器官是膜的细胞和因而,荧光在细胞表面 (a) 被分配,并且强制曲线陈列特定断开的活动 (c) 的高百分比。 在 DA 应用以后的 10 分钟,所有荧光集中到小的小点 (b),并且 specifi c 活动没有被记录证明的生效数量所有感受器官向内了到原生质。

反而,多个小的细胞内萤光泡变量在大小上和亮光被观察指示可能的感受器官内在化 (图 2B)。 对配合基 DA 的有效的捆绑的此观察点对 D1 感受器官的在 SH-SY5Y 细胞塑造。 注意弱的荧光发信号必需我们使用久曝光时间得到荧光图象。 为了避免可能的漂白的影响我们在 DA 的应用时关闭了荧光快门并且开张了它在获取这个图象之前。

除荧光想象之外, DA - D1 感受器官断开的强制被记录了使用 AFM 强制在活细胞的数量模式在不同的时间点在出现和缺乏多巴胺。 强制一个单细胞的数量想象与一个 DAfunctionalized 技巧的在时间点 t0 (没有 D1 感受器官的刺激) 导致 signifi 伪善言辞部分 (13.12%) 的陈列一个特定断开的活动 (图 2C) 的强制曲线。

平行对光学观察,强制评定也进行了在时间点 t10min (在 D1 感受器官的刺激以后由 DA 的)。 如图第 2 所显示,所有记录的强制曲线陈列了没有特定断开的活动,因而支持我们的观察由 D1 感受器官的内在化的荧光想象到原生质。 我们没有查找此现象是可逆的在 1 时数 DA 刺激以后。 图象和定期流逝电影比较确认荧光模式的被观察的更改是内在化进程的一种直接结果。

结果

在我们的研究中, DA - 二感受器官交往陈列了在 223 ± 被集中的唯一断开的强制 82 pN 附近。 有趣地,平均最大值是稳定的,当评定在这个细胞的边缘,而最严格的差异和上限值对在细胞核附近被采取的评定被观察了。 迄今,在多巴胺和其感受器官之间的交往结构不充分地了解。 研究 向 其 潜在 的 感受 器官 报告 多巴胺 的 配药 特性 , 以及 许多 其 收缩筋 和 反对者 , 。 根据感受器官类型,发现离解常数在 880 和 2980 毫微米之间。

动态强制分光学可能为运动参数的确定也使用。 在我们运作的设置,所有 AFM 扫描在同样条件下执行,作为贷款利率功能,但是变化扫描参数和密谋断开的强制也是可能的。 , 如果 这 个 断开 的 进程 的 动能学 依靠 能源 横向 的 内在 或 外面 障碍 , 曲线 级数 可能 情报 至于 是否 。 运动比率常数离解off (k) 可能也是确定的。

由根本,密谋黏附力强制作为贷款利率的对数功能在收缩时,而保持恒定和互作用时间接近航速,将显示能垒的长度缩放比例。 曲线的 Extraoplation 在强制零的将产生 K。off

另一方面,密谋作为互作用时间功能的黏附力频率,当保留恒定这个途径和收缩速度时将给需要的互作用时间的束缚的半最大的概率。 终于,认识关联费率常数 (k)on,可以确定平衡常数如下: KD = K/Koffon.

结论

当前调查展示联合的 AFM 和荧光显微法潜在学习多巴胺 D1 感受器官出现和黏合性在活细胞表面的。 在应用注解此两部分系列关于使用的 AFM 在 neurodegenerative 疾病的研究中 (参见 AN117 : 分开 I) 于用于生命科学应用的二个主要技术的综合化集中的实验。 结合光学显微学技术与 AFM 准许:

  1. 3D 分子的确定由 BF、 DIC、荧光和 AFM 高度图象的利益。
  2. 目标分子的物理属性的调查通过光学想象和地形学,摩擦,黏弹性和黏附力数据。
  3. 一个蜂窝电话信号活动的实时观察在亚显微缩放比例的。
  4. 特定断开的强制的评定在配合基和其感受器官之间和在进一步一定程度上,他们的运动参数的确定。 最后选项在领域开辟巨大的可能性的药理,特别是药物发现。

通过结合光学显微学与 AFM,这不仅提供用户以两个技术的福利在一个唯一实验的,它为这个范例也提供容易进入和处理的一种高灵活性。 我们相信这些研究提供令人信服结果至于这样多重模态分布的手段的值,并且帮助加速在神经学研究的预付款。

此信息是来源,复核和适应从 Bruker 纳诺表面提供的材料。

关于此来源的更多信息请参观 Bruker 纳诺表面

Date Added: Jun 22, 2009 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:03

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