學習多巴胺和 D1 感受器官之間的交往在使用基本強制顯微學的 SH-SY5Y 細胞

包括的事宜

簡介
範例準備
使用跟蹤的 AFM 狂歡對膜 D1 感受器官的多巴胺
結果
結論

簡介

除其高分辨率想像功能之外,基本強制顯微學 (AFM)湧現了作為為評定 nanomechanical 屬性和生物化子的複雜交往強制的一個強大的工具。 當大部分 AFM 研究的這些類型在查出的分子,為了真的生物相關性時執行在活細胞系統應該理想地說進行這些調查。

另外,能耦合與其他技術的 AFM 像光學顯微學為了同時收集數據的兩個類型現在看上去重要。 到目前為止,非常少量研究在 AFM 和被倒置的光學顯微學基礎上的組合。

在本研究中我們調查強制評定的潛在的應用在監控多巴胺 D1 感受器官回應和黏合性的在與多巴胺的刺激。 我們使用一個充分地集成 AFM 和 epifluorescence 系統關聯熒光想像和 AFM 強制評定。

多巴胺 (DA, 4 (2 氨基) 苯 1,2 二醇) 是屬於兒茶酚胺系列的一個主要神經傳送體,根據稱酚基乙氨酸的芳香氨基酸,并且是二種主要激素前體: 腎上腺素和 noradrenalin。

在周圍神經系統,多巴胺的主要角色是調整心血管功能作為強壯劑、激素銷售量、腎臟功能、血管流和食道能動性。 在這個中央神經系統 (CNS),多巴胺在運動的功能、認知、情感、攝食和內分泌管理規定控制介入。 多巴胺能的神經傳遞的官能不良在 CNS 的與各種各樣神經精神病學的紊亂被鏈接,包括 Tourette 的綜合症狀、帕金森病、精神分裂症、偏執狂和注意力不集中活動過度紊亂 (ADHD)。 多巴胺感受器官從 D1 被分類到 D1 和 D2 感受器官組成最大的比例的 D5。 對於這些疾病的處理多巴胺能的藥物的確定無副作用是其中一在神經細胞的研究和藥物發現的大挑戰。

使用強制分光學和我們的集成工具,光學想像功能在此特殊研究中,我們使用一種 YFP 被標記的橫跨膜 D1 感受器官調查此感受器官和多巴胺modifi 編輯 AFM 技巧之間的交往 specifi 城市。

範例準備

SH-SY5Y 細胞 transfected 與 YFP 標記的多巴胺 D1 感受器官 (DRD1-EYFP)。 轉染由 nucleofection (Nucelofector, AMAXA) 執行使用細胞暫掛 (10 个6 cells/ml), 4 µg 質粒脫氧核糖核酸和 100 µl 轉染緩衝 (AMAXA)。 隨後,細胞是種子在不育的蓋子清單 (18x18 mm) 在 6-well 牌照。 48 h 在表示轉染依附的細胞以後 DRD1-EYFP 刺激了與 10-50 µM 多巴胺氯化物。

Brightfield (BF)、 DIC 和 epifluorescence 圖像在用 AxioCam MRC 照相機和 AxioVision 軟件裝備的蔡司 Axio 觀察員倒置顯微鏡獲取了。 使用 DNP/MSCT 懸臂,所有 AFM 圖像在充分地集成與光學顯微鏡的 AFM 被記錄了。

使用 PBS 緩衝和最軟的 DNP- 和 MSCT 型的懸臂 (名義上的彈簧常數 0.06 N/m 和 0.01N/m,所有實驗在聯絡TappingMode™執行,分別。)。 Dopaminefunctionalized 懸臂如前所述準備。

簡而言之,聚乙二醇 (PEG)衍生商品,有一個氨基易反應的末端和一個硫烴易反應的末端,使用了作為連接器和作為一個惰性後面 fi lling 的分子,以便仅多巴胺能造成被觀察的約束交往。 彈簧常數在僵硬的技術支持 (培養皿的玻璃底層的流體被計算了),并且偏轉靈敏度在這個軟件手動地被更新了。 總共 3072 強制曲線記錄了生效數量模式,以在 3 和 3.5 Hz 之間的掃瞄速率和與 10 女士縮回延遲。 掃描區是 2x2 µm。

使用跟蹤的 AFM 狂歡對膜 D1 感受器官的多巴胺

overexpressed YFP 標記的 D1 感受器官主要在質膜在神經細胞的 SH-SY5Y 細胞局限化并且顯示一個任意配電器。 基於熒光數據感受器官向內到細胞質在與多巴胺的刺激。 為了支持此假說和測試 AFM 的潛在的應用,我們跟蹤 DA 的捆綁對膜 D1 感受器官和他們隨後的內在化。

首先, DNP 懸臂 functionalized 以多巴胺類似物如圖 1. 所示。 在下一個步驟活細胞顯示在從 10 的幾 DA 濃度到 50 µM 為了刺激 D1 膜感受器官。

在一個活細胞的圖 1. 學習的配合基感受器官交往。 AFM 技巧 functionalized,在這種情況下在交往多巴胺 (DA)介入的化工份額與其 D1 感受器官保留。 另外,這個間隔號的長度使這個技巧的作用對交往減到最小。

Epifluorescence 圖像和 timelapse 電影被記錄檢測在 D1 感受器官配電器上螢光信號的變化和因而,調查 YFP 標記的多巴胺 D1 感受器官的內在化和黏合性。

圖 2A 顯示這個實驗在 t0 : 此時點,未應用多巴胺,并且因而, D1 感受器官沒有被刺激。 結果, YFP 標記的 D1 感受器官保持膜顯示一同類螢光弄髒在細胞表面間。 在螢光配電器上的一個重大的變化達到在 D1 感受器官的刺激由 DA。 圖 2B 顯示圖像的一個典型的示例被記錄在 T。10min 對於所有 DA 濃度,膜 fl uorescence 未在 10 分鐘孵出以後被檢測。

圖 2. 關聯的熒光想像和 AFM 強制評定。 在應用自由的 DA 前後, AFM 技巧標記以 DA 類似物按照 YFP 標記的 D1 感受器官的地點。 在 DA 的刺激前,感受器官是膜的細胞和因而,熒光在細胞表面 (a) 被分配,并且強制曲線陳列特定斷開的活動 (c) 的高百分比。 在 DA 應用以後的 10 分鐘,所有熒光集中到小的小點 (b),并且 specifi c 活動沒有被記錄證明的生效數量所有感受器官向內了到原生質。

反而,多個小的細胞內螢光泡變量在大小上和亮光被觀察指示可能的感受器官內在化 (圖 2B)。 對配合基 DA 的有效的捆綁的此觀察點對 D1 感受器官的在 SH-SY5Y 細胞塑造。 注意弱的熒光發信號必需我們使用久曝光時間得到熒光圖像。 為了避免可能的漂白的影響我們在 DA 的應用時關閉了熒光快門并且開張了它在獲取這個圖像之前。

除熒光想像之外, DA - D1 感受器官斷開的強制被記錄了使用 AFM 強制在活細胞的數量模式在不同的時間點在出現和缺乏多巴胺。 強制一個單細胞的數量想像與一個 DAfunctionalized 技巧的在時間點 t0 (沒有 D1 感受器官的刺激) 導致 signifi 偽善言辭部分 (13.12%) 的陳列一個特定斷開的活動 (圖 2C) 的強制曲線。

平行對光學觀察,強制評定也進行了在時間點 t10min (在 D1 感受器官的刺激以後由 DA 的)。 如圖第 2 所顯示,所有記錄的強制曲線陳列了沒有特定斷開的活動,因而支持我們的觀察由 D1 感受器官的內在化的熒光想像到原生質。 我們沒有查找此現象是可逆的在 1 時數 DA 刺激以後。 圖像和定期流逝電影比較確認熒光模式的被觀察的更改是內在化進程的一種直接結果。

結果

在我們的研究中, DA - 二感受器官交往陳列了在 223 ± 被集中的唯一斷開的強制 82 pN 附近。 有趣地,平均最大值是穩定的,當評定在這個細胞的邊緣,而最嚴格的差異和上限值對在細胞核附近被採取的評定被觀察了。 迄今,在多巴胺和其感受器官之間的交往結構不充分地瞭解。 研究嚮其潛在的感受器官報告多巴胺的配藥特性,以及許多其收縮筋和反對者。 根據感受器官類型,發現離解常數在 880 和 2980 毫微米之間。

動態強制分光學可能為運動參數的確定也使用。 在我們運作的設置,所有 AFM 掃描在同樣條件下執行,作為貸款利率功能,但是變化掃描參數和密謀斷開的強制也是可能的。 如果這個斷開的進程的動能學依靠能源橫向的內在或外面障礙,曲線級數可能情報至於是否。 運動比率常數離解off (k) 可能也是確定的。

由根本,密謀黏附力強制作為貸款利率的對數功能在收縮時,而保持恆定和互作用時間接近航速,將顯示能壘的長度縮放比例。 曲線的 Extraoplation 在強制零的將產生 K。off

另一方面,密謀作為互作用時間功能的黏附力頻率,當保留恆定這個途徑和收縮速度時將給需要的互作用時間的束縛的半最大的概率。 終於,認識關聯費率常數 (k)on,可以確定平衡常數如下: KD = K/Koffon.

結論

當前調查展示聯合的 AFM 和熒光顯微法潛在學習多巴胺 D1 感受器官出現和黏合性在活細胞表面的。 在應用註解此兩部分系列關於使用的 AFM 在 neurodegenerative 疾病的研究中 (參見 AN117 : 分開 I) 於用於生命科學應用的二個主要技術的綜合化集中的實驗。 結合光學顯微學技術與 AFM 准許:

  1. 3D 分子的確定由 BF、 DIC、熒光和 AFM 高度圖像的利益。
  2. 目標 分子 的 物理 屬性 的 調查 通過 光學 想像 和 地形學 , 摩擦 , 黏彈性 和 黏附力 數據 。
  3. 一個蜂窩電話信號活動的實時觀察在亞顯微縮放比例的。
  4. 特定斷開的強制的評定在配合基和其感受器官之間和在進一步一定程度上,他們的運動參數的確定。 最後選項在領域開闢巨大的可能性的藥理,特別是藥物發現。

通過結合光學顯微學與 AFM,這不僅提供用戶以兩個技術的福利在一個唯一實驗的,它為這個範例也提供容易進入和處理的一種高靈活性。 我們相信這些研究提供令人信服結果至於這樣多重模態分佈的手段的值,并且幫助加速在神經學研究的預付款。

此信息是來源,覆核和適應從 Bruker 納諾表面提供的材料。

關於此來源的更多信息请請參觀 Bruker 納諾表面

Date Added: Jun 22, 2009 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:05

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