UntersuchungsInteraktion Zwischen Antikörpern und Peptid Microspots

Themen Umfaßt

Zusammenfassung
Einleitung
Experimentelle Prozedur
Fluoreszenz Analyse
Sarfus-Analyse
Ergebnisse und Diskussion
Schlussfolgerung
Vorteile von Sarfus

Zusammenfassung

Interaktion zwischen Antikörpern und Peptid microspots werden mit Sarfus-Technik studiert. Vor Ausbrütung zeigt Maß, dass die microspot Stärke gegen die Konzentration der Druckpeptidlösung erhöht. Ausbrütung mit Antikörpern ergibt die Entstehung einer Proteinschicht auf dem Peptid microspot, das leicht unter Verwendung Sarfus-Technik gekennzeichnet wurde.

Diese Arbeit wurde in veröffentlicht: V. Souplet, R. Desmet, O.Melnyk, J.Pept. Sci. , 2007; 13:451-457.

Einleitung

Peptid Microarrays liefern eine attraktive Technologie, um komplexe Proben für das Vorhandensein und/oder die Funktion von biologischen Parametern zu prüfen. Optische, elektrische oder mechanische Methoden können für den Befund der erfassten Moleküle angewendet werden. Wir zeigen hier, dass Sarfus eine schnelle Darstellung von den Proteinfilmen erlaubt, die durch das Besonderen gebildet werden, das von gekleideten Peptidfühlern erfasst wird.

Experimentelle Prozedur

Fluoreszenz Analyse

Fluoreszenzbefund wurde an 532nm unter Verwendung eines confocal Microarraystandardscanners durchgeführt.

Sarfus-Analyse

In dieser Studie ist die oberste Schicht der Brandungssubstratflächen SiO2 („StandardBrandung "). Optische Bilder werden auf einem optischen Mikroskop LEICA DM4000 erhalten und montiert über eine Kamera SONYS 3CCD. Die 2D Bilder werden mit Sarfusoft (Nanolane-Software) behandelt und nach Kalibrierung, werden Bilder 3D erzeugt.

Ergebnisse und Diskussion

Die Warnschildpeptide, die von Grippe hemagglutinin und (HA) von myc Protein (myc) berechnet wurden wurden in dieser Studie verwendet. Sie wurden auf 2 nm-Amin-geänderten SiO-Substratflächen2 unter Verwendung eines berührungsfreien piezoelektrischen arrayer gedruckt (Abbildung 1) bei verschiedenen Konzentrationen von 0,5 bis 100µM (6 Konzentrationen, 3 Absinken, Gesamtes 1nL). Schließlich wurden StandardBrandung mit BSA gewaschen und gesättigt.

Abbildung 1. Antikörpererfassung auf HA- und mycpeptid microspot.

Die Methode, die angewendet wird, um die microspot Stärke mengenmäßig zu bestimmen, wird auf dem Peptid HA (100µM) ausgebrütet mit Ha-Antikörpern (10µg/mL) dargestellt. Abbildung 2A-Show ein typisches Sarfus-Bild. Nach Kalibrierung werden Falschfarbeschuppe und 3D-Ansichten (Abbildungen 2B u. 2C) der Stelle erhalten. Schichtstärke wurde leicht nach Profilextraktion bestimmt (Abbildung 2D).

Abbildung 2. Microspot des Peptids HA (100µM) gedruckt auf StandardBrandung silanized mit aminopropyltrimethoxysilane 3 und brütete aus (1h bei 37°C) mit Mause-Antikörpern antiHA (10µg/ml). A) Sarfus-Bild. B) Falsch-Farbebild. C) 3D-Ansicht. D) Profilextraktion (von punktierter Zeile auf 2B).

Wir prüften als Nächstes die Besonderheit der Antikörperschichtenbildung. Für dieses wurden Ausbrütungen (1h an 37°C, an 250µg/mL) mit AntiHA oder anti--myc Mauseantikörper in Anwesenheit Tween® aufeinander folgende Wäschen 20 und 2% (BSA) Rinderdas Serum Albumine dann mit PBS, Wasser und Äthanol durchgeführt.

Antikörper Anti-HA auf Peptid HA (Abbildung 3A) und anti--myc Antikörper auf Peptid myc (Abbildung 3D) zeigten eine Stelle an, während keine bedeutende Änderung für das HA-microspot in Anwesenheit des anti--myc Antikörpers (Abbildung 3B) und für die myc microspots in Anwesenheit des Antikörpers AntiHA beobachtet werden könnte (Abbildung 3C).

Abbildungen 3. Sarfus-Bilder von HA-Peptide Microarrays brüteten mit einem AntiHA (5A) oder anti--myc Antikörpern (5B) und von mit einem AntiHA (5C) ausgebrüteten oder anti--myc myc Peptide Microarrays aus (5D).

Der Effekt des Peptids oder des AntiHA Antikörperkonzentration auf die Stärke der HA- oder mycmicrospots wurde geprüft (Abbildung 4A). Die Peptide wurden bei sechs verschiedenen Konzentrationen (von 0,5 bis 100µM) gedruckt und jede Antikörperkonzentration (von 0,01 zu 10µg/ml) wurde in dreifacher Ausführung geprüft. Die Stellenhöhen (entsprechend der mittleren und interquartile Reichweite microspot Höhen) wurden gefunden, um in hohem Grade reproduzierbar zu sein.

Bei niedriger Peptidkonzentration (1µM), ist die Oberflächenkonzentration des Peptids/der Antikörperkomplexe vermutlich nicht die Höhe, genug, zum eine Schicht stärker als die umgebende BSA-Schicht zu geben (Abbildung 5). Eine Hochebene für eine Peptidkonzentration über 10µM wird erreicht, was auch immer die Antikörperkonzentration ist. Dieses wird Sättigung der Oberfläche durch Peptide über dieser Konzentration zugeschrieben. Im Gegensatz zu HA-microspot waren die Höhen des Peptid myc microspot in Anwesenheit der Antikörper AntiHA an 10µg/mL nicht zu denen beträchtlich unterschiedlich, die nachdem sie sich gewaschen hatten mit BSA/Tween 20® erreicht wurden und die Besonderheit der Antikörperschichtenbildung dargestellt.

Abbildungen 4. A. Evolution der Stellenstärke gegen Peptidkonzentration B. Relationship zwischen Peptid HA-microspot Höhe und AntiHA Antikörperkonzentration.

Ein sollte das lineare Verhältnis (r=0.98)2 beachten beobachtet zwischen der Konzentration des Antikörpers AntiHA und HA (50µM) microspot Höhe (Abbildung 4B).

Abbildung 5. Skizze der Oberfläche nach BSA-Aufnahme.

Schlussfolgerung

Sarfus erlaubt die schnelle Darstellung von den Proteinschichten, die durch die spezifische Schwergängigkeit von Antikörpern zu den Reihenpeptidfühlern gebildet werden. Ein lineares Verhältnis zwischen der Schichtstärke und der Antikörperkonzentration wurde gefunden.

Vorteile von Sarfus

Die Vorteile von Sarfus umfassen:

  • Schnelle Kennzeichnungstechnik für statistische Ergebnisse
  • Nicht Kontakt, der nicht Technik beschriftet
  • Blickfeld (von 60µm2 zu einigen mm2)
  • Analyse bei Zimmertemperatur und Atmosphärendruck

Quelle: Nanolane

Zu mehr Information über diese Quelle besuchen Sie bitte Nanolane

Date Added: Sep 6, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 23:13

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