Acción Recíproca de Investigación Entre los Anticuerpos y el Péptido Microspots

Temas Revestidos

Extracto
Introducción
Procedimiento Experimental
Análisis de la Fluorescencia
Análisis de Sarfus
Resultados y Discusión
Conclusión
Ventajas de Sarfus

Extracto

La Acción Recíproca entre los anticuerpos y los microspots del péptido se estudia con la técnica de Sarfus. Antes de la incubación, la medición muestra que el espesor del microspot aumenta comparado con la concentración de la solución impresa del péptido. La Incubación con los anticuerpos da lugar a la formación de una capa de la proteína en el microspot del péptido que fue caracterizado fácilmente usando la técnica de Sarfus.

Este trabajo fue publicado en: V. Souplet, R. Desmet, O.Melnyk, J.Pept. Sci. , 2007; 13:451-457.

Introducción

Los microarrays del Péptido proporcionan a una tecnología atractiva para sondar las muestras complejas para la presencia y/o la función de analitos biológicos. Los métodos Ópticos, eléctricos o mecánicos se pueden utilizar para la detección de las moléculas capturadas. Mostramos aquí que Sarfus permite una proyección de imagen rápida de las películas de la proteína formadas por el específico capturado de antenas puestas en orden de los péptidos.

Procedimiento Experimental

Análisis de la Fluorescencia

La detección de la Fluorescencia fue realizada en 532nm usando un analizador confocal estándar del microarray.

Análisis de Sarfus

En este estudio, la capa superior de los substratos de la Resaca es SiO2 (“Resaca Estándar "). Las imágenes Ópticas se obtienen en un microscopio óptico de LEICA DM4000 y cerco vía una cámara de SONY 3CCD. Las 2.as imágenes se tratan con Sarfusoft (software de Nanolane) y después de la calibración, se generan las imágenes 3D.

Resultados y Discusión

Los péptidos de la Etiqueta derivados del hemagglutinin y (HA) de la proteína del myc (myc) de la gripe fueron utilizados en este estudio. Fueron impresos en 2 substratos nanómetro-amina-modificados2 de SiO usando un arrayer piezoeléctrico sin contacto (Cuadro 1) en diversas concentraciones a partir de la 0,5 hasta el 100µM (6 concentraciones, 3 caídas, guardapolvo 1nL). Finalmente, la Resaca Estándar fue lavada y saturada con BSA.

Cuadro 1. captura del Anticuerpo en microspot del péptido de la HA y del myc.

El método usado para cuantificar el espesor del microspot se ilustra en el péptido HA (el 100µM) incubado con los Ha-anticuerpos (10µg/mL). Figura demostración de 2A una imagen típica de Sarfus. Después de la calibración, la escala del falso-color y las vistas 3D (Figuras 2B y 2C) de la mancha se obtienen. El espesor de la Capa fue determinado fácilmente después de la extracción del perfil (Figura 2.a).

El Cuadro 2. Microspot del péptido HA (el 100µM) impreso en la Resaca Estándar silanized con el aminopropyltrimethoxysilane 3 e incubó (1h en 37°C) con los anticuerpos murine anti-HA (10µg/ml). A) Imagen de Sarfus. B) imagen del Falso-Color. C) opinión de 3D. D) Extracción del Perfil (de línea de puntos en 2B).

Examinamos después la especificidad de la formación de la capa del anticuerpo. Para esto, las incubaciones (1h en 37°C, 250µg/mL) con anti-HA o los anticuerpos murine antis-myc en presencia de Tween® las estelas turbulentas sucesivas Vacunas de Albumine del Suero de 20 (BSA) y del 2% entonces con PBS, agua y el etanol fueron realizados.

El anticuerpo Anti-HA en el péptido HA (Figura 3A) y el anticuerpo anti-myc en el myc del péptido (Figura 3D) visualizaron una mancha mientras que ningún cambio importante se podría observar para el microspot de la HA en presencia del anticuerpo anti-myc (Figura 3B) y para los microspots del myc en presencia del anticuerpo anti-HA (Figura 3C).

Los Cuadros 3. imágenes de Sarfus de los microarrays de los péptidos de la HA incubaron con una anti-HA (5A) o los anticuerpos antis-myc (5B) y de los microarrays de los péptidos del myc incubados con una anti-HA (5C) o antis-myc (5D).

El efecto del péptido o de anti-HA de concentración del anticuerpo sobre el espesor de los microspots de la HA o del myc fue examinado (Figura 4A). Los péptidos fueron impresos en seis diversas concentraciones (a partir la 0,5 al 100µM) y cada concentración del anticuerpo (a partir de la 0,01 a 10µg/ml) fue probada en triplicado. Las alturas de la mancha (correspondiente al rango mediano e intercuartil de las alturas del microspot) fueron encontradas para ser altamente reproductivas.

En la concentración inferior del péptido (el 1µM), la concentración superficial de péptido/de complejos del anticuerpo no es probablemente altura bastante para dar una capa más gruesa que la capa circundante de BSA (Cuadro 5). Un platillo para una concentración del péptido encima del 10µM se alcanza sea cual sea la concentración del anticuerpo es. Esto es atribuida a la saturación de la superficie por los péptidos encima de esta concentración. En contraste con microspot de la HA, las altitudes del microspot del myc del péptido en presencia de los anticuerpos anti-HA en 10µg/mL no eran importante diferentes de ésas obtenidas después de lavarse con BSA/Tween 20®, ilustrando la especificidad de la formación de la capa del anticuerpo.

Cuadros 4. A. Evolution del espesor de la mancha comparado con la concentración B. Relationship del péptido entre la altura del microspot de la HA del péptido y anti-HA de concentración del anticuerpo.

Uno debe observar el lazo lineal (r=0.982) observado entre la concentración y la HA (los 50µM) del anticuerpo anti-HA de altura del microspot (Figura 4B).

Cuadro 5. Esbozo de la superficie después de la adsorción de BSA.

Conclusión

Sarfus permite la proyección de imagen rápida de las capas de la proteína formadas por el atascamiento específico de anticuerpos a las antenas de los péptidos del arsenal. Un lazo lineal entre el espesor de la capa y la concentración del anticuerpo fue encontrado.

Ventajas de Sarfus

Las ventajas de Sarfus incluyen:

  • Técnica Rápida de la caracterización para los resultados estadísticos
  • No contacto no etiqueta técnica
  • Campo visual (a partir del 60µm2 a varios milímetros2)
  • Análisis en la temperatura ambiente y la presión atmosférica

Fuente: Nanolane

Para más información sobre esta fuente visite por favor Nanolane

Date Added: Sep 6, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 23:42

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