Interaction Vérifiante Entre les Anticorps et le Peptide Microspots

Sujets Couverts

Résumé
Introduction
Méthode Expérimentale
Analyse de Fluorescence
Analyse de Sarfus
Résultats et Discussion
Conclusion
Avantages de Sarfus

Résumé

L'Interaction entre les anticorps et les microspots de peptide sont étudiées avec la technique de Sarfus. Avant incubation, la mesure prouve que l'épaisseur de microspot augmente contre la concentration de la solution estampée de peptide. L'Incubation avec des anticorps a comme conséquence la formation d'une couche de protéine sur le microspot de peptide qui a été facilement caractérisé utilisant la technique de Sarfus.

Ce travail a été publié dans : V. Souplet, R. Desmet, O.Melnyk, J.Pept. Sci. , 2007 ; 13:451-457.

Introduction

Les puces ADN de Peptide fournissent une technologie attrayante pour sonder les échantillons complexes pour la présence et/ou le fonctionnement des analytes biologiques. Des méthodes Optiques, électriques ou mécaniques peuvent être utilisées pour le dépistage des molécules capturées. Nous prouvons ici que Sarfus permet une représentation rapide des films de protéine constitués par le détail capturé des sondes rangées de peptides.

Méthode Expérimentale

Analyse de Fluorescence

Le dépistage de Fluorescence a été exécuté à 532nm utilisant un balayeur confocal normal de puce ADN.

Analyse de Sarfus

Dans cette étude, la couche le plus élevé des substrats de Ressac est SiO2 ("Ressac Normal "). Des images Optiques sont obtenues sur un microscope optique de LEICA DM4000 et rassemblées par l'intermédiaire d'un appareil-photo de SONY 3CCD. Les 2D images sont traitées avec Sarfusoft (logiciel de Nanolane) et après étalonnage, les images 3D sont produites.

Résultats et Discussion

Des peptides de Balise dérivés du hemagglutinin de grippe (HA) et de la protéine de myc (myc) ont été utilisés dans cette étude. Ils ont été estampés sur 2 substrats nanomètre-amine-modifiés2 de SiO utilisant un arrayer piézoélectrique de non contact (le Schéma 1) aux concentrations différentes de 0,5 à 100µM (6 concentrations, 3 gouttes, combinaison 1nL). En Conclusion, le Ressac Normal étaient lavé et saturé avec BSA.

Le Schéma 1. capture d'Anticorps sur le microspot de peptide d'HA et de myc.

La méthode employée pour mesurer l'épaisseur de microspot est illustrée sur le peptide HA (100µM) incubé avec des Ha-anticorps (10µg/mL). Figure exposition de 2A une image typique de Sarfus. Après étalonnage, l'échelle de trompeur-couleur et les vues 3D (Figures 2B et 2C) de l'endroit sont obtenues. L'épaisseur de Couche a été facilement déterminée après extraction de profil (Figure 2D).

Le Schéma 2. Microspot du peptide HA (100µM) estampé sur le Ressac Normal silanized avec l'aminopropyltrimethoxysilane 3 et a incubé (1h à 37°C) avec des anticorps anti-HA murins (10µg/ml). A) Image de Sarfus. B) image de Trompeur-Couleur. C) vue de 3D. D) Extraction de Profil (du trait pointillé sur 2B).

Nous avons ensuite examiné la spécificité de la formation de couche d'anticorps. Pour ceci, les incubations (1h à 37°C, à 250µg/mL) avec anti-HA ou les anti-myc anticorps murins en présence de Tween® les lavages successifs d'Albumine de Sérum De Boeuf de 20 (BSA) et de 2% puis avec PBS, eau et éthanol ont été exécutés.

L'anticorps Anti-HA sur le peptide HA (Figure 3A) et l'anti-myc anticorps sur le myc de peptide (Figure 3D) ont affiché un endroit attendu qu'on ne pourrait observer aucune évolution important pour le microspot d'HA en présence du l'anti-myc anticorps (Figure 3B) et pour les microspots de myc en présence de l'anticorps anti-HA (Figure 3C).

Les Schémas 3. images de Sarfus des puces ADN de peptides d'HA ont incubé avec un anti-HA (5A) ou les anti-myc anticorps (5B) et des puces ADN de peptides de myc incubées avec un anti-HA (5C) ou anti-myc (5D).

L'effet du peptide ou du l'anti-HA de concentration en anticorps sur l'épaisseur des microspots d'HA ou de myc a été examiné (Figure 4A). Les peptides ont été estampés à six concentrations différentes (de 0,5 à 100µM) et chaque concentration en anticorps (de 0,01 à 10µg/ml) a été testée en triple. Les hauteurs d'endroit (correspondant au domaine médian et interquartile des hauteurs de microspot) se sont avérées hautement reproductibles.

À la concentration faible en peptide (1µM), la concentration extérieure du peptide/des composés d'anticorps n'est probablement pas assez hauteur pour donner une couche plus épaisse que la couche environnante de BSA (le Schéma 5). Un plateau pour une concentration en peptide au-dessus de 10µM est atteint celui qui la concentration en anticorps soit. Ceci est attribué à saturation de la surface par des peptides au-dessus de cette concentration. Contrairement au microspot d'HA, les altitudes du microspot de myc de peptide en présence des anticorps anti-HA à 10µg/mL n'étaient pas sensiblement différentes de ceux obtenues après lavage avec BSA/Tween 20®, illustrant la spécificité de la formation de couche d'anticorps.

Les Schémas 4. A. Evolution de l'épaisseur d'endroit contre la concentration en peptide B. Relationship entre la hauteur de microspot d'HA de peptide et l'anti-HA de concentration en anticorps.

On devrait noter la relation linéaire (r=0.982) observée entre la concentration en anticorps anti-HA et HA (50µM) de hauteur de microspot (Figure 4B).

Le Schéma 5. Croquis de la surface après l'adsorption de BSA.

Conclusion

Sarfus permet la représentation rapide des couches de protéine constituées par la liaison particulière des anticorps aux sondes de peptides d'alignement. Une relation linéaire entre l'épaisseur de couche et la concentration en anticorps a été trouvée.

Avantages de Sarfus

Les avantages de Sarfus comprennent :

  • Technique Rapide de caractérisation pour des résultats statistiques
  • Non contact étiquetant non la technique
  • Champ de vision (de 60µm2 à plusieurs millimètres2)
  • Analyse à la température ambiante et à la pression atmosphérique

Source : Nanolane

Pour plus d'informations sur cette source visitez s'il vous plaît Nanolane

Date Added: Sep 6, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 23:09

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