Interazione Studiante Fra gli Anticorpi ed il Peptide Microspots

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Estratto
Introduzione
Procedura Sperimentale
Analisi di Fluorescenza
Analisi di Sarfus
Risultati e Discussione
Conclusione
Vantaggi di Sarfus

Estratto

L'Interazione fra gli anticorpi e i microspots del peptide è studiata con la tecnica di Sarfus. Prima di incubazione, la misura indica che lo spessore del microspot aumenta contro la concentrazione della soluzione stampata del peptide. Incubazione con i risultati degli anticorpi nella formazione di livello della proteina sul microspot del peptide che è stato caratterizzato facilmente facendo uso della tecnica di Sarfus.

Questa opera è stata pubblicata in: V. Souplet, R. Desmet, O.Melnyk, J.Pept. Sci. , 2007; 13:451-457.

Introduzione

I microarrays del Peptide forniscono una tecnologia attraente per sondare i campioni complessi per la presenza e/o la funzione di analiti biologici. I metodi Ottici, elettrici o meccanici possono essere usati per la rilevazione delle molecole catturate. Indichiamo qui che Sarfus permette una rappresentazione rapida delle pellicole della proteina costituite dallo specifico catturato delle sonde allineate dei peptidi.

Procedura Sperimentale

Analisi di Fluorescenza

La rilevazione della Fluorescenza è stata realizzata a 532nm facendo uso di uno scanner confocale standard di microarray.

Analisi di Sarfus

In questo studio, il livello superiore dei substrati della Spuma è SiO2 (" Spuma Standard "). Le immagini Ottiche sono ottenute su un microscopio ottico di LEICA DM4000 e sono raccolte via una macchina fotografica di SONY 3CCD. Le 2D immagini sono trattate con Sarfusoft (software di Nanolane) e dopo la calibratura, le immagini 3D sono generate.

Risultati e Discussione

I peptidi del Tag derivati dal hemagglutinin di influenza (HA) e dalla proteina del myc (myc) sono stati utilizzati in questo studio. Sono stati stampati su 2 substrati nanometro-ammina-modificati2 di SiO facendo uso di un arrayer piezoelettrico senza contatto (Figura 1) alle concentrazioni diverse da 0,5 a 100µM (6 concentrazioni, 3 gocce, camice 1nL). Per Concludere, la Spuma Standard è stata lavata e saturato stata con BSA.

Figura 1. bloccaggio dell'Anticorpo sul microspot del peptide del myc e dell'HA.

Il metodo impiegato per quantificare lo spessore del microspot è illustrato sul peptide l'HA (100µM) incubato con gli Ha-anticorpi (10µg/mL). Figura manifestazione di 2A un'immagine tipica di Sarfus. Dopo la calibratura, il disgaggio di falso-colore e 3D le visualizzazioni (Figure 2B & 2C) del punto sono ottenuti. Lo spessore del Livello è stato determinato facilmente dopo l'estrazione di profilo (Figura 2D).

La Figura 2. Microspot del peptide HA (100µM) stampato su Spuma Standard silanized con aminopropyltrimethoxysilane 3 ed ha incubato (1h a 37°C) con anti-HA gli anticorpi murini (10µg/ml). A) Immagine di Sarfus. B) immagine di Falso-Colore. C) visualizzazione di 3D. D) Estrazione di Profilo (dalla linea punteggiata su 2B).

Dopo abbiamo esaminato la specificità di formazione del livello dell'anticorpo. Per questo, le incubazioni (1h a 37°C, a 250µg/mL) con anti-HA o gli anticorpi murini anti--myc in presenza di Tween® lavaggi successivi di Albumine del Siero Bovino di 2% (BSA) e di 20 poi con PBS, acqua ed etanolo sono stati eseguiti.

L'anticorpo Anti-HA sul peptide l'HA (Figura 3A) e l'anticorpo anti--myc sul myc del peptide (Figura 3D) video un punto mentre nessun cambiamento significativo potrebbe essere osservato per il microspot dell'HA in presenza dell'anticorpo anti--myc (Figura 3B) e per i microspots del myc in presenza anti-HA dell'anticorpo (Figura 3C).

Le Figure 3. immagini di Sarfus dei microarrays dei peptidi dell'HA hanno incubato con un anti-HA (5A) o gli anticorpi anti--myc (5B) e dei microarrays dei peptidi del myc incubati con un anti-HA (5C) o anti--myc (5D).

L'effetto del peptide o di anti-HA di concentrazione nell'anticorpo sullo spessore dei microspots del myc o dell'HA è stato esaminato (Figura 4A). I peptidi sono stati stampati a sei concentrazioni differenti (0,5 - 100µM) ed ogni concentrazione nell'anticorpo (da 0,01 a 10µg/ml) è stata provata in triplice copia. Le altezze del punto (corrispondendo alla differenza mediana ed interquartile delle altezze del microspot) sono state trovate per essere altamente riproducibili.

A concentrazione bassa nel peptide (1µM), la concentrazione di superficie di peptide/complessi dell'anticorpo non è probabilmente altezza abbastanza per dare un livello più spesso del livello circostante di BSA (Figura 5). Un plateau per una concentrazione nel peptide superiore a 10µM è raggiunto qualunque la concentrazione nell'anticorpo è. Ciò è attribuita a saturazione della superficie dai peptidi sopra questa concentrazione. Contrariamente al microspot dell'HA, le altitudini del microspot del myc del peptide in presenza degli anticorpi anti-HA a 10µg/mL non erano significativamente differenti da quelle ottenute dopo avere lavato con BSA/Tween 20®, illustrante la specificità della formazione del livello dell'anticorpo.

Figure 4. A. Evolution di spessore del punto contro concentrazione B. Relationship nel peptide fra altezza del microspot dell'HA del peptide e anti-HA di concentrazione nell'anticorpo.

Uno dovrebbe notare la relazione lineare (r=0.982) osservata fra la concentrazione nell'anticorpo anti-HA e l'HA (50µM) di altezza del microspot (Figura 4B).

Figura 5. Schizzo della superficie dopo adsorbimento di BSA.

Conclusione

Sarfus permette la rappresentazione rapida dei livelli della proteina costituiti dal legame specifico degli anticorpi alle sonde dei peptidi di schiera. Una relazione lineare fra lo spessore del livello e la concentrazione nell'anticorpo è stata trovata.

Vantaggi di Sarfus

I vantaggi di Sarfus includono:

  • Tecnica Veloce di caratterizzazione per i risultati statistici
  • Non contatto non che contrassegna tecnica
  • Campo visivo (da 60µm2 a parecchi millimetri2)
  • Analisi alla temperatura ambiente ed alla pressione atmosferica

Sorgente: Nanolane

Per ulteriori informazioni su questa sorgente visualizzi prego Nanolane

Date Added: Sep 6, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 23:17

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