Het Onderzoeken Interactie Tussen Antilichamen en Peptide Microspots

Besproken Onderwerpen

Samenvatting
Inleiding
Experimentele Procedure
De Analyse van de Fluorescentie
De Analyse van Sarfus
Resultaten en Bespreking
Conclusie
Voordelen van Sarfus

Samenvatting

De Interactie tussen antilichamen en peptide wordt microspots bestudeerd met techniek Sarfus. Vóór incubatie, toont de meting aan dat de microspotdikte tegenover de concentratie van de afgedrukte peptide oplossing stijgt. De Incubatie met antilichamen resulteert in de vorming van een eiwitlaag op peptide microspot die gemakkelijk gebruikend techniek Sarfus werd gekenmerkt.

Dit werk werd gepubliceerd in: V. Souplet, R. Desmet, O.Melnyk, J.Pept. Sc.i. , 2007; 13:451457.

Inleiding

Peptide microarrays verstrekt een aantrekkelijke technologie om complexe steekproeven voor de aanwezigheid en/of de functie van biologische analytes te sonderen. De Optische, elektro of mechanische methodes kunnen voor de opsporing van de gevangen molecules worden gebruikt. Wij tonen hier aan dat Sarfus een snelle weergave van eiwitdiefilms toestaat door specifiek worden gevormd gevangen van opgestelde peptides sondes.

Experimentele Procedure

De Analyse van de Fluorescentie

Opsporing van de Fluorescentie werd uitgevoerd bij 532nm gebruikend een standaard confocal microarray scanner.

De Analyse van Sarfus

In deze studie, is de hoogste laag substraten van de Branding SiO2 („StandaardBranding“). De Optische beelden worden verkregen op een optische microscoop LEICA DM4000 en via een camera van SONY 3CCD verzameld. De 2D beelden worden behandeld met Sarfusoft (software Nanolane) en na kaliberbepaling, worden 3D beelden geproduceerd.

Resultaten en Bespreking

Peptides van de Markering uit griep hemagglutinin en (HA) myc proteïne (myc) wordt afgeleid werden gebruikt in deze studie die. Zij werden afgedrukt op 2 NM-amine-gewijzigde substraten2 SiO gebruikend een noncontact piezoelectric arrayer (Figuur 1) bij verschillende concentraties van 0.5 aan 100µM (6 concentraties, 3 dalingen, 1nL globaal). Tot Slot werd de StandaardBranding gewassen en werd verzadigd met BSA.

Figuur 1. Het Antilichaam vangt op HA en myc peptide microspot.

De methode wordt gebruikt om de microspotdikte te kwantificeren is geïllustreerd die op peptide HA (100µM) met Ha-Antilichamen (10µg/mL die) wordt uitgebroed. De Figuur 2A toont een typisch beeld Sarfus. Na kaliberbepaling, worden de vals-kleurenschaal en 3D meningen (Cijfers 2B & 2C) van de vlek verkregen. Dikte van de Laag werd gemakkelijk bepaald na profielextractie (Cijfer tweede).

Figuur 2. Microspot van peptide HA (100µM) op StandaardBranding wordt afgedrukt silanized met aminopropyltrimethoxysilane 3 en broedde (1h bij 37°C) met rattenantilichamen anti-Ha uit (10µg/ml die). A) beeld Sarfus. B) het beeld van de vals-Kleur. C) 3D mening. D) de extractie van het Profiel (van gestippelde lijn op 2B).

Wij onderzochten daarna de specificiteit van de vorming van de antilichamenlaag. Voor dit, werden de incubaties (1h bij 37°C, 250µg/mL) met anti-Ha of anti-anti-myc rattenantilichamen in aanwezigheid van Tween® 20 en 2% de Runder opeenvolgende wassen (BSA) van Albumine van het Serum toen met PBS, water en ethylalcohol uitgevoerd.

Het antilichaam anti-Ha op peptide HA (Figuur 3A) en het anti-anti-mycantilichaam op peptide myc (3D Cijfer) toonden een vlek terwijl geen significante verandering voor HA microspot in aanwezigheid van anti-anti-mycantilichaam (Cijfer 3B) en voor myc microspots in aanwezigheid van het antilichaam anti-Ha (Cijfer 3C) zou kunnen worden waargenomen.

Figuren 3. Beelden van Sarfus van peptides van HA microarrays broedden met anti-Ha (5A) of antidie (5B) antilichamen en van met anti-Ha (5C) wordt uitgebroed of anti -anti-myc mycpeptides microarrays uit (5D).

Het effect van peptide of anti-Ha antilichamenconcentratie op de dikte van HA werd of myc microspots onderzocht (Figuur 4A). Peptides werden afgedrukt bij zes verschillende concentraties (van 0.5 aan 100µM) en elke antilichamenconcentratie (van 0.01 aan 10µg/ml) werd in drievoud getest. De vlekhoogten (beantwoordend aan de midden en interquartile waaier van microspothoogten) werden gevonden hoogst reproduceerbaar om te zijn.

Bij lage peptide concentratie (1µM), zijn de oppervlakteconcentratie van peptide/de antilichamencomplexen waarschijnlijk geen hoogte genoeg om een laag te geven dikker dan de omringende laag BSA (Figuur 5). Een plateau voor een peptide concentratie boven 10µM wordt bereikt wat de antilichamenconcentratie is. Dit wordt toegeschreven aan verzadiging van de oppervlakte door peptides boven deze concentratie. In tegenstelling tot HA microspot, waren de hoogten van peptide myc microspot in aanwezigheid van antilichamen anti-Ha bij 10µg/mL niet beduidend verschillend van die verkregen na was die met BSA/Tween 20®, de specificiteit van de vorming van de antilichamenlaag illustreert.

Figuren 4. A. Evolutie van vlekdikte versus peptide concentratie B. Relationship tussen peptide de hoogte van HA microspot en anti-Ha antilichamenconcentratie.

Men zou van de lineaire die verhouding (r=0.98) moeten2 nota nemen tussen de anti-Ha antilichamenconcentratie en HA wordt waargenomen (50µM) microspot hoogte (Cijfer 4B).

Figuur 5. Schets van de oppervlakte na adsorptie BSA.

Conclusie

Sarfus staat de snelle weergave van eiwitdielagen toe door de specifieke band van antilichamen aan seriepeptides sondes worden gevormd. Een lineair verband tussen de laagdikte en de antilichamenconcentratie werd gevonden.

Voordelen van Sarfus

De voordelen van Sarfus omvatten:

  • Snelle karakteriseringstechniek voor statistische resultaten
  • Contact dat Niet niet techniek etiketteert
  • Gebied van mening (van 60µm2 aan verscheidene mm2)
  • Analyse bij kamertemperatuur en luchtdruk

Bron: Nanolane

Voor meer informatie over deze bron te bezoeken gelieve Nanolane

Date Added: Sep 6, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 23:06

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit