Interacção de Investigação Entre Anticorpos e Peptide Microspots

Assuntos Cobertos

Sumário
Introdução
Procedimento Experimental
Análise da Fluorescência
Análise de Sarfus
Resultados e Discussão
Conclusão
Vantagens de Sarfus

Sumário

A Interacção entre anticorpos e microspots do peptide é estudada com técnica de Sarfus. Antes da incubação, a medida mostra que a espessura do microspot aumenta contra a concentração da solução impressa do peptide. A Incubação com anticorpos conduz à formação de uma camada da proteína no microspot do peptide que foi caracterizado facilmente usando a técnica de Sarfus.

Este trabalho foi publicado em: V. Souplet, R. Desmet, O.Melnyk, J.Pept. Sci. , 2007; 13:451-457.

Introdução

Os microarrays do Peptide fornecem uma tecnologia atractiva para sondar amostras complexas para a presença e/ou a função de analytes biológicos. Os métodos Ópticos, elétricos ou mecânicos podem ser usados para a detecção das moléculas capturadas. Nós mostramos aqui que Sarfus permite uma imagem lactente rápida dos filmes da proteína formados pelo específico capturado de pontas de prova postas dos peptides.

Procedimento Experimental

Análise da Fluorescência

A detecção da Fluorescência foi executada em 532nm usando um varredor confocal padrão do microarray.

Análise de Sarfus

Neste estudo, a camada o mais elevado das carcaças da Ressaca é SiO2 (“Ressaca Padrão "). As imagens Ópticas são obtidas em um microscópio óptico de LEICA DM4000 e recolhidas através de uma câmera de SONY 3CCD. As 2D imagens são tratadas com o Sarfusoft (software de Nanolane) e após a calibração, as imagens 3D são geradas.

Resultados e Discussão

Os peptides da Etiqueta derivados do hemagglutinin da gripe (HA) e da proteína do myc (myc) foram usados neste estudo. Foram imprimidos em 2 carcaças nanômetro-amina-alteradas2 de SiO usando um arrayer piezoeléctrico noncontact (Figura 1) em concentrações diferentes de 0,5 a 100µM (6 concentrações, 3 gotas, macacão 1nL). Finalmente, a Ressaca Padrão foi lavada e saturada com BSA.

Figura 1. captação do Anticorpo no microspot do peptide do HA e do myc.

O método usado para determinar a espessura do microspot é ilustrado no peptide HA (100µM) incubado com HA-anticorpos (10µg/mL). Figura mostra de 2A uma imagem típica de Sarfus. Após a calibração, a escala da falso-cor e as vistas 3D (Figuras 2B & 2C) do ponto são obtidas. A espessura da Camada foi determinada facilmente após a extracção do perfil (Figura 2D).

A Figura 2. Microspot do peptide HA (100µM) impresso na Ressaca Padrão silanized com aminopropyltrimethoxysilane 3 e incubou (1h em 37°C) com os anticorpos anti-HA murine (10µg/ml). A) Imagem de Sarfus. B) imagem da Falso-Cor. C) opinião de 3D. D) Extracção do Perfil (da linha pontilhada em 2B).

Nós examinamos em seguida a especificidade da formação da camada do anticorpo. Para isto, as incubação (1h em 37°C, em 250µg/mL) com anti-HA ou os anti-myc anticorpos murine na presença de Tween® lavagens sucessivas Bovinas de Albumine do Soro de 20 (BSA) e de 2% então com PBS, água e álcool etílico foram executados.

O anticorpo Anti-HA no peptide HA (Figura 3A) e o anti-myc anticorpo no myc do peptide (Figura 3D) indicaram um ponto visto que nenhuma mudança significativa poderia ser observada para o microspot do HA na presença do anti-myc anticorpo (Figura 3B) e para os microspots do myc na presença do anticorpo anti-HA (Figura 3C).

As Figuras 3. imagens de Sarfus de microarrays dos peptides do HA incubaram com um anti-HA (5A) ou os anti-myc anticorpos (5B) e dos microarrays dos peptides do myc incubados com um anti-HA (5C) ou anti-myc (5D).

O efeito do peptide ou do anti-HA da concentração do anticorpo na espessura dos microspots do HA ou do myc foi examinado (Figura 4A). Os peptides foram imprimidos em seis concentrações diferentes (0,5 a 100µM) e cada concentração do anticorpo (de 0,01 a 10µg/ml) foi testada a em três exemplares. As alturas do ponto (correspondendo à escala mediana e interquartile de alturas do microspot) foram encontradas para ser altamente reprodutíveis.

Na baixa concentração do peptide (1µM), a concentração de superfície de peptide/complexos do anticorpo não está provavelmente a uma altura bastante para dar uma camada mais grossa do que a camada circunvizinha de BSA (Figura 5). Um platô para uma concentração do peptide acima de 10µM é alcançado o que quer que a concentração do anticorpo é. Isto é atribuído à saturação da superfície por peptides acima desta concentração. Em contraste com o microspot do HA, as alturas do microspot do myc do peptide na presença dos anticorpos anti-HA em 10µg/mL não eram significativamente diferentes daquelas obtidas após o lavagem com o BSA/Tween 20®, ilustrando a especificidade da formação da camada do anticorpo.

Figuras 4. A. Evolução da espessura do ponto contra a concentração B. Relacionamento do peptide entre a altura do microspot do HA do peptide e o anti-HA da concentração do anticorpo.

Um deve notar o relacionamento linear (r=0.982) observado entre a concentração do anticorpo anti-HA e (50µM) HA da altura do microspot (Figura 4B).

Figura 5. Esboço da superfície após a adsorção de BSA.

Conclusão

Sarfus permite a imagem lactente rápida das camadas da proteína formadas pelo emperramento específico dos anticorpos às pontas de prova dos peptides da disposição. Um relacionamento linear entre a espessura da camada e a concentração do anticorpo foi encontrado.

Vantagens de Sarfus

As vantagens de Sarfus incluem:

  • Técnica Rápida da caracterização para resultados estatísticos
  • Não contacto que etiqueta não a técnica
  • Campo de visão (de 60µm2 a diversos milímetros2)
  • Análise na temperatura ambiente e na pressão atmosférica

Source: Nanolane

Para obter mais informações sobre desta fonte visite por favor Nanolane

Date Added: Sep 6, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 23:36

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