Расследуя Взаимодействие Между Антителами и Пептидом Microspots

Покрытые Темы

Конспект
Введение
Экспириментально Процедура
Флуоресцентный Анализ
Анализ Sarfus
Результаты и Обсуждение
Заключение
Преимущества Sarfus

Конспект

Взаимодействие между антителами и microspots пептида изучено с методом Sarfus. Перед инкубацией, измерение показывает что толщина microspot увеличивает против концентрации напечатанного разрешения пептида. Инкубация с антителами приводит к в образовании слоя протеина на microspot пептида которое легко было охарактеризовано используя метод Sarfus.

Эта работа была опубликована в: V. Souplet, R. Desmet, O.Melnyk, J.Pept. Sci. , 2007; 13:451-457.

Введение

Microarrays Пептида обеспечивают привлекательную технологию для того чтобы зондировать сложные образцы для присутсвия и/или функции биологических analytes. Оптически, электрические или механически методы можно использовать для обнаружения захваченных молекул. Мы показываем здесь что Sarfus позволяет быстрому воображению фильмов протеина сформированных специфическим захваченным одетых зондов пептидов.

Экспириментально Процедура

Флуоресцентный Анализ

Обнаружение Флуоресцирования было выполнено на 532nm используя стандартный confocal блок развертки microarray.

Анализ Sarfus

В этом изучении, topmost слой субстратов Прибоя SiO2 ("Стандартный Прибой "). Оптически изображения получены на микроскопе LEICA DM4000 оптически и собраны через камеру СОНИ 3CCD. 2D изображения обработаны с Sarfusoft (ПО Nanolane) и после тарировки, произведены изображения 3D.

Результаты и Обсуждение

Пептиды Бирки выведенные от hemagglutinin инфлуензы (HA) и протеина myc (myc) были использованы в этом изучении. Они были напечатаны на 2 nm-амин-доработанных субстратах2 SiO используя внеконтактное пьезоэлектрическое arrayer (Диаграмму 1) на различной концентрации от 0,5 до 100µM (6 концентраций, 3 падения, прозодежда 1nL). Окончательно, Стандартный Прибой был помыт и был насыщен с BSA.

Диаграмма 1. захват Антитела на microspot пептида HA и myc.

Метод используемый для того чтобы квантифицировать толщину microspot проиллюстрирован на пептиде HA (100µM) инкубированном с HA-антителами (10µg/mL). Диаграмма выставка 2A типичное изображение Sarfus. После тарировки, получены маштаб ложн-цвета и взгляды 3D (Диаграммы 2B & 2C) пятна. Толщина Слоя легко была определена после извлечения профиля (Диаграммы 2D).

Диаграмма 2. Microspot пептида HA (100µM) напечатанного на Стандартном Прибое silanized с aminopropyltrimethoxysilane 3 и инкубировала (1h на 37°C) с murine антителами анти--HA (10µg/ml). A) Изображение Sarfus. Изображение Ложн-Цвета B). Взгляд 3D C). D) Извлечение Профиля (от пунктирной линии на 2B).

Мы затем рассмотрели характерность образования слоя антитела. Для этого, были выполнены инкубации (1h на 37°C, 250µg/mL) с анти--HA или анти--myc murine антитела в присутствии к Tween® мыть Albumine Сыворотки 20 и (BSA) 2% Bovine после этого последовательные с PBS, водой и этанолом.

Антитело Анти--HA на пептиде HA (Диаграмме 3A) и анти--myc антитело на myc пептида (Диаграмме 3D) показали пятно тогда как никакое значительно изменение не смогло наблюдаться для microspot HA в присутствии к анти--myc антителу (Диаграмме 3B) и для microspots myc в присутствии к антителу анти--HA (Диаграмма 3C).

Диаграммы 3. изображения Sarfus microarrays пептидов HA инкубировали с анти--HA (5A) или анти--myc антителами (5B) и microarrays пептидов myc инкубированных с анти--HA (5C) или анти--myc (5D).

Было расмотрено влияние пептида или анти--HA концентрации антитела на толщине microspots HA или myc (Диаграмма 4A). Пептиды были напечатаны на 6 различных концентрациях (от 0,5 до 100µM) и каждая концентрация антитела (от 0,01 к 10µg/ml) была испытана в triplicate. Были найдены, что были высоты пятна (соответствие к медиане и межквартильному размаху высот microspot) сильно возпроизводимыми.

На низкой концентрации пептида (1µM), концентрация на поверхности пептида/комплексов антитела нет вероятно высоты достаточно для того чтобы дать слой толщино чем окружающий слой BSA (Диаграмма 5). Достигается плато для концентрации пептида над 10µM все, что угодно концентрация антитела. Это приписано к сатурации поверхности пептидами над этой концентрацией. В отличие от microspot HA, высоты microspot myc пептида в присутствии к антителам анти--HA на 10µg/mL не отличили значительно высотполученные после мыть при BSA/Tween 20®, иллюстрируя характерность образования слоя антитела.

Диаграммы 4. A. Развитие толщины пятна против концентрации B. Отношения пептида между высотой microspot HA пептида и анти--HA концентрации антитела.

Одно должно заметить линейное отношение (r=0.982) наблюдаемое между концентрацией антитела анти--HA и (50µM) HA высоты microspot (Диаграммы 4B).

Диаграмма 5. Эскиз поверхности после адсорбции BSA.

Заключение

Sarfus позволяет быстрому воображению слоев протеина сформированных специфической вязкой антител к зондам пептидов блока. Было найдено линейное отношение между толщиной слоя и концентрацией антитела.

Преимущества Sarfus

Преимущества Sarfus включают:

  • Быстрый метод характеризации для статистически результатов
  • Non контакт non обозначая метод
  • Область видимости (от 60µm2 к нескольким mm2)
  • Анализ на комнатной температуре и атмосферном давлении

Источник: Nanolane

Для больше информации на этом источнике пожалуйста посетите Nanolane

Date Added: Sep 6, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 23:39

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit