Utforska Växelverkan Mellan Antikroppar och Peptiden Microspots

Täckte Ämnen

Abstrakt begrepp
Inledning
Experimentellt Tillvägagångssätt
FluorescenceAnalys
Sarfus Analys
Resultat och Diskussion
Avslutning
Fördelar av Sarfus

Abstrakt begrepp

Växelverkan mellan antikroppar och peptidemicrospots är utstuderad med den Sarfus tekniken. För inkubation visar mätningen att microspottjockleksförhöjningarna kontra koncentrationen av den utskrivavna peptidelösningen. Inkubation med antikroppar resulterar i bildandet av ett proteinlagrar på peptidemicrospoten som karakteriserades lätt genom att använda den Sarfus tekniken.

Detta arbete publicerades i: V. Souplet, R. Desmet, O.Melnyk, J.Pept. Sci. , 2007; 13:451-457.

Inledning

Peptidemicroarrays ger en attraktiv teknologi till sondkomplex tar prov för närvaroen och/eller fungerar av biologiska analytes. Optiska, elektriska eller mekaniska metoder kan användas för upptäckten av de fångade molekylarna. Vi visar här att Sarfus låter avbilda för for av protein filmar bildat av närmare detalj som fångas av ställa i ordning peptidessonder.

Experimentellt Tillvägagångssätt

FluorescenceAnalys

Fluorescenceupptäckt utfördes på 532nm genom att använda en standard confocal microarraybildläsare.

Sarfus Analys

I denna studie är det översta lagrar av Bränningsubstratesna SiO2 (”Standard Bränning”). Optiskt avbildar erhålls på ett optiskt mikroskop för LEICA DM4000 och samlas via en SONY 3CCD kamera. 2D avbildar behandlas med Sarfusoft (Nanolane programvara), och efter kalibrering, avbildar 3D frambrings.

Resultat och Diskussion

Märka peptides som härledas från influensahemagglutinin, (HA) och mycprotein (myc) användes i denna studie. De skrivevs ut på 2 nm-amine-ändrade SiO2 substrates genom att använda en noncontact piezoelectric arrayer (Figurera 1), på olika koncentrationer från 0,5 till 100µM (6 koncentrationer, 3 tappar, overallen 1nL). Slutligen tvättades genomdränktes den Standarda Bränningen och med BSA.

Figurera 1. Antikropptillfångatagande på HA- och mycpeptidemicrospot.

Den van vid metoden kvantifierar microspottjockleken illustreras på peptiden HA (100µM) som kläckas med HA-antikroppar (10µg/mL). Figurera showen 2A som en typiska Sarfus avbildar. Falsk-färga fjäll, och 3D beskådar (Figurerar 2B & 2C), av fläcken erhålls Efter kalibrering. Lagrartjocklek var beslutsam efter profilerar lätt extraktion (Figurera 2D).

Figurera 2. Microspot av peptiden HA (100µM) som skrivevs ut på den Standarda Bränningen, silanized med aminopropyltrimethoxysilane 3 och kläckte (1h på 37°C) med murine antikroppar anti-HA (10µg/ml). A) Sarfus avbildar. B) Falsk-Färgar avbildar. C) 3D beskådar. D) Profilera extraktion (från prickigt fodra på 2B).

Vi undersökte därefter noggrannheten av antikropplagrarbildande. För detta bevattnar inkubationer (1h på 37°C, 250µg/mL) med anti-HA eller anti-myc murine antikroppar i närvaroen av Tween® SerumAlbumine för 20 och 2% (BSA) Nötkreaturs- därefter på varandra följande washes med PBS, och ethanol utfördes.

Antikroppen Anti-HA på peptiden HA (Figurera 3A) och den anti-myc antikroppen på peptidemyc (Figurera 3D), visade en fläck, eftersom ingen viktig ändring kunde observeras för HA-microspoten i närvaroen av den anti-myc antikroppen (Figurerar 3B) och för mycmicrospotsna i närvaroen av antikroppen anti-HA (Figurera 3C).

Figurerar 3. Sarfus avbildar av HA-peptidesmicroarrays som kläckas med enHA (5A) eller anti-myc antikroppar (5B) och av anti-myc mycpeptidesmicroarrays som kläckas med enHA (5C) eller (5D).

Verkställa av peptiden eller anti-HA antikroppkoncentration på tjockleken av HA- eller mycmicrospotsna undersöktes (Figurera 4A). Peptidesna skrivevs ut på sex olika koncentrationer (från 0,5 till 100µM), och varje antikroppkoncentration (från 0,01 till 10µg/ml) testades i triplicate. Fläckhöjderna (som motsvarar till det median- och interquartile, spänna av microspothöjder), fanns för att vara högt reproducible.

På låg peptidekoncentration (1µM), är ytbehandlakoncentrationen av peptiden/antikroppkomplex antagligen inte höjd nog som ger ett lagrar mer tjock än det omgeende BSA-lagrar (Figurera 5). En platå för en peptidekoncentration ovanför 10µM nes, allt vad antikroppkoncentrationen är. Detta tillskrivas till saturation av ytbehandla av peptides ovanför denna koncentration. I kontrast till HA-microspot var höjderna av peptidemycmicrospoten i närvaroen av antikroppar anti-HA på 10µg/mL inte markant olika från de erhållande efter tvagning med BSA/Tween 20® som illustrerar noggrannheten av antikropplagrarbildandet.

Figurerar 4. A. Evolution av fläcktjocklek vs. peptidekoncentration B. Förhållande mellan höjd för peptideHA-microspot och anti-HA antikroppkoncentration.

Man bör notera det linjära förhållandet (r=0.982) som observeras mellan koncentrationen för antikroppen anti-HA och HA (50µM) microspothöjd (Figurera 4B).

Figurera 5. Skissa av ytbehandla efter BSA-adsorption.

Avslutning

Sarfus låter avbilda för for av proteinlagrar som bildas av det specifika bandet av antikroppar till samlingpeptidessonder. Ett linjärt förhållande mellan lagrartjockleken och antikroppkoncentrationen fanns.

Fördelar av Sarfus

Fördelarna av Sarfus inkluderar:

  • Fasta karakteriseringtekniken för statistiska resultat
  • Kontakta Non märkande den non tekniken
  • Sätta In av beskådar (från 60µm2 till flera en mm2)
  • Analys på rumstemperaturen och atmosfäriska pressar

Källa: Nanolane

För mer information på denna källa behaga besök Nanolane

Date Added: Sep 6, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 23:46

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit