Zählung, Bearbeiten und SichtbarmachungsAnhäufung in den Proteinen Unter Verwendung der Nanoparticle-GleichlaufAnalyse

Durch AZoNano

Themen Umfaßt

Einleitung
Darstellung Protein-Gesamtheiten
Umfassen der Protein-GesamtGrößen-Reichweite
Subvention 30 nm-Gesamtheiten
30 - 1000 nm Reichweite

Einleitung

Den Aggregatzustand in den Proteinen Zu Kennzeichnen ist von entscheidender Bedeutung beim Versuchen, Produktstabilität und -wirksamkeit zu verstehen. Produktqualität, im Hinblick auf biologische Aktivität und Immunisierungsfähigkeitsdose, wird in hohem Grade durch den Zustand der Proteinaggregation beeinflußt. Proteinaggregation kann an allen Schritten im Herstellungsverfahren (Zellkultur, Reinigung und Formulierung) auftreten und folglich, indem man den Aggregatzustand bestimmt, können Modifikation/Optimierung des Prozesses erzielt werden.

Ein neuer Laser-basierter Nanoparticle, der Analyseanlage aufspürt, ist jetzt, die nanoscale Partikel erlaubt, wie Protein ansammelt erhältlich, in der Flüssigkeit in der Istzeit direkt und einzeln sichtbar zu machen und gezählt, von der hochauflösende Teilchengrößeverteilungsprofile erreicht werden können. Die Technik ist die schnellen, robusten, genauen und niedrigen Kosten, die eine attraktive Alternative oder eine Ergänzung zu vorhandenen Methoden der Nanoparticleanalyse wie Dynamischer Lichtstreuung darstellen, DLS (alias Photon-Wechselbeziehungs-Spektroskopie, PCS) oder Elektronenmikroskopie (EM).

Darstellung Protein-Gesamtheiten

Das NanoSight-Instrument bietet eindeutigen Einblick in Proteinaggregation im Bereich von 30 nm-1000 nm an.

Abbildung 1. Ein typisches Bild produzierte durch die NanoSight-Technik. Das Bild erlaubt den Benutzern, bestimmte Merkmale über ihre Probe sofort zu erkennen.

Abbildung 2. Teilchengrößeverteilung (Zahlverteilung) produziert aus der Probe gezeigt in Abbildung 1.

Umfassen der Protein-GesamtGrößen-Reichweite

Historisch sind einige Techniken verwendet worden, um Proteine und Proteinaggregation zu kennzeichnen. Häufig werden Trennungstechniken verwendet, um Proteine und Proteingesamtheiten zu unterscheiden, wenn die weitere Analyse an einer getrennten Probe durchgeführt ist.

Analytische Techniken:

Trennung Techniken:

  • Größe Ausschluss-Chromatographie (SEC)
  • Bereich Fluss-Fraktionierung (FFF)
  • Haarartige Elektrophorese. (CER)
  • Analytische Ultrazentrifugation (AUC)

Subvention 30 nm-Gesamtheiten

Es ist geläufig, SEK zu finden zusammengepaßt mit DLS, MALLEN oder UVspektroskopie. Größe Ausschluss-Chromatographie kann verwendet werden, um sich Proteinmonomeren von den Gesamtheiten zu trennen. Nachfolgende Analyse unter Verwendung DLS zum Beispiel, kann genaue Größe/Molekulargewichtanalyse für gereinigte Brüche produzieren. Über der Ausschlussgrenze auf die SEK-Spalte gibt es keine Trennung und ist folglich Analyseanlagen wie DLS werden weniger gut angepasst sperrig. MALL-Analyse kann helfen, den Effekt von größeren Gesamtheiten in nicht-fraktionierten Proben zu verringern, aber die Technik benötigt Interpretation.

30 - 1000 nm Reichweite

Die NanoSight-Technik lässt Proteingesamtheiten innerhalb des Größenbereiches 30 - 1000 nm abgebildet und sortiert einzeln sein, indem sie ihre Brownische Bewegung auf einer Partikel-durchpartikel Basis aufspürt. Partikel-durch-Partikel Analyse erlaubt, dass Zahlverteilungen der hohen Auflösung erzeugt werden. Diese Region wird häufig schlecht durch DLS mit hoher Konzentration der Proteinmonomere und der geringen Anzahl großer, heller Gesamtheiten gedient, die häufig das Signal beherrschen.

Während Fraktionierung wie mit FFF zur Analyse des Beraters DLS durchgeführt werden kann, kann die Verdünnung, die häufig für FFF gefordert wird, diesen Weg Undesirable machen wegen des Potenzials für weitere Anhäufung. Außerdem nimmt Verdünnung dieser „mittelgroßen“ Gesamtheiten sie häufig unterhalb der Empfindlichkeitsgrenze für DLS. Die Nanosight-Technik benötigt häufig keine Verdünnung, während die 30-1000 nm-Proteingesamtheiten häufig innerhalb des optimalen Konzentrationsbereichs für diese Technik fallen.

Die abgeschnittene Grenze auf die NanoSight-Technik (30 nm für Proteingesamtheiten) bedeutet, dass sie gut angepasst ist, SEC/DLS oder SEC/UV über der Ausschlussgrenze auf SEK ergäzunzen. Die obere Grenze auf die NanoSight-Technik stellt den Punkt dar, an dem herkömmliche einzelne Partikeldarstellungs-/-verdunkelungstechniken anwendbar werden.

Ohne frühere Trennung von Gesamtheiten, würde DLS gewöhnlich ein Ergebnis mit zwei Verfahren für die angesammelte Probe liefern, die in Abbildung 3. gezeigt wurde. Die Hauptspitze wurde vorbei gebildet von der großen Anzahl von monomeren Partikeln, während die Sekundärspitze durch sehr große Gesamtheiten gebildet würde, die beträchtliche Intensität der Leuchte zerstreuen. Eine schlecht entschlossene DLS-Analyse würde darstellen, dass keine Partikel zwischen diesen Punkten trotz ihres Bestehens als der monomeren Hauptpartikel und den wenigen größeren Gesamtheiten das Signal beherrschen würden.

Abbildung 3. Bild produzierte durch Instrument Nanosight LM10-HS, das eine schwer angesammelte Proteinprobe zeigt.

Während die NanoSight-Technik nicht imstande sein würde, die monomere Hauptgröße zu messen, da die Partikel unterhalb der Nachweisgrenze auf die Technik, über 30 nm, die Technik fallen würden, stellt Partikel-durchpartikel Analyse von Proteingesamtheiten zur Verfügung und eindeutig bildet eine hochauflösende Zahlverteilung von angesammelten Partikeln.

Abbildung 4. Eine Darstellung der Verteilung der Teilchengrößen, die möglicherweise innerhalb einer angesammelten Proteinprobe enthalten werden.

Diese Informationen sind Ursprungs- angepasst gewesen, wiederholt und von den Materialien, die von NanoSight bereitgestellt werden.

Zu mehr Information besuchen Sie bitte NanoSight.

Date Added: Dec 22, 2009 | Updated: Mar 7, 2013

Last Update: 7. March 2013 09:27

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