Contagem, Cola e Agregação Visualizando nas Proteínas Usando a Análise de Seguimento do Nanoparticle

Por AZoNano

Assuntos Cobertos

Introdução
Agregados da Proteína da Imagem Lactente
Cobrindo a Escala do Tamanho do Agregado da Proteína
Sub 30 Agregados do nanômetro
Escala de 30 - de 1000 nanômetro

Introdução

Caracterizar o estado de agregação nas proteínas é da importância primordial ao tentar compreender a estabilidade e a eficácia do produto. A qualidade de Produto, em termos da lata da actividade biológica e da imunogenicidade, seja influenciada altamente pelo estado de agregação da proteína. A agregação da Proteína pode ocorrer em todas as etapas no processo de manufactura (cultura celular, purificação e formulação) e daqui, determinando o estado de agregação, a alteração/optimização do processo pode ser conseguida.

Um nanoparticle baseado no laser novo que segue o sistema de análise está agora disponível que permite partículas do nanoscale, tais como a proteína agrega, para visualizar directamente e individualmente e contar no líquido no tempo real, de que os perfis de alta resolução da distribuição de tamanho da partícula podem ser obtidos. A técnica é custo rápido, robusto, exacto e baixo que representam uma alternativa atractiva ou um complemento aos métodos existentes da análise do nanoparticle tais como a Dispersão de Luz Dinâmica, DLS (igualmente conhecido como a Espectroscopia da Correlação do Fotão, PCS) ou Microscopia de Elétron (EM).

Agregados da Proteína da Imagem Lactente

O instrumento de NanoSight oferece a introspecção original na agregação da proteína na escala de 30 nm-1000 nanômetro.

Figura 1. Uma imagem típica produziu pela técnica de NanoSight. A imagem permite que os usuários reconheçam imediatamente determinadas características sobre sua amostra.

Figura 2. distribuição de tamanho da Partícula (distribuição do número) produzida da amostra mostrada em Figura 1.

Cobrindo a Escala do Tamanho do Agregado da Proteína

Um número de técnicas foram usadas Historicamente para caracterizar proteínas e agregação da proteína. As técnicas de separação são usadas Frequentemente para discriminar proteínas e agregados da proteína, com a análise mais aprofundada executada em uma amostra separada.

Técnicas Analíticas:

Técnicas de Separação:

  • Cromatografia da Exclusão do Tamanho (SEC)
  • Fraccionamento de Fluxo de Campo (FFF)
  • Electroforese Capilar. (CE)
  • Ultracentrifugation Analítico (AUC)

Sub 30 Agregados do nanômetro

É comum encontrar o SEGUNDO emparelhado com o DLS, as ALAMEDAS ou a espectroscopia UV. A Cromatografia da Exclusão do Tamanho pode ser usada para separar monómeros da proteína dos agregados. A análise Subseqüente usando DLS por exemplo, pode produzir o tamanho exacto/a análise peso molecular para fracções refinadas. Acima do limite de exclusão da coluna do SEGUNDO não há nenhuma separação e daqui aumenta sistemas de análise tais como DLS transforma-se menos bem - serido. A análise das ALAMEDAS pode ajudar a reduzir o efeito de agregados maiores em amostras não-fraccionadas mas a técnica exige a interpretação.

Escala de 30 - de 1000 nanômetro

A técnica de NanoSight permite que os agregados da proteína dentro da escala do tamanho de 30 - 1000 nanômetro sejam individualmente imaged e feitos sob medida seguindo seu movimento Brownian em uma base da partícula-por-partícula. a análise da Partícula-por-Partícula permite que as distribuições de alta resolução do número sejam geradas. Esta região frequentemente é servida deficientemente por DLS com concentração alta de monómero da proteína e baixo número de grandes, agregados brilhantes que dominam frequentemente o sinal.

Enquanto o fraccionamento pode ser executado como com FFF à análise do assistente DLS, a diluição que é exigida frequentemente para FFF pode fazer este undesirable da rota devido ao potencial para uma agregação mais adicional. Além Disso, a diluição destes “meados de-fez sob medida” agregados toma-os frequentemente abaixo do limite da sensibilidade para DLS. A técnica de Nanosight não exige freqüentemente nenhuma diluição enquanto os 30-1000 agregados da proteína do nanômetro caem frequentemente dentro da escala de concentração a melhor para esta técnica.

O limite eliminado da técnica de NanoSight (30 nanômetro para agregados da proteína) significa que é poço - serido para complementar SEC/DLS ou SEC/UV acima do limite de exclusão de SEGUNDO. O limite superior da técnica de NanoSight representa o ponto em que as únicas técnicas convencionais da imagem lactente/ocultação da partícula se tornam aplicáveis.

Sem a separação prévia de agregados, DLS produziria tipicamente um resultado bimodal para a amostra agregada mostrada em Figura 3. O pico preliminar formado perto do grande número de partículas monomeric, quando o pico secundário seria formado pelos agregados muito grandes que dispersam intensidades significativas da luz. Uma análise deficientemente resolved de DLS mostraria que nenhuma partícula entre estes pontos apesar de sua existência como as partículas monomeric preliminares e poucos agregados maiores dominaria o sinal.

A Figura 3. Imagem produziu pelo instrumento de Nanosight LM10-HS que mostra uma amostra pesadamente agregada da proteína.

Enquanto a técnica de NanoSight seria incapaz de medir o tamanho monomeric preliminar porque as partículas cairiam abaixo do limite de detecção da técnica, acima de 30 nanômetro, a técnica fornece a análise da partícula-por-partícula de agregados da proteína, formando excepcionalmente uma distribuição de alta resolução do número de partículas agregadas.

Figura 4. Uma representação da distribuição das dimensão das partículas que podem ser contidas dentro de uma amostra agregada da proteína.

Esta informação foi originária, revista e adaptada dos materiais fornecidos por NanoSight.

Para mais informação visite por favor NanoSight.

Date Added: Dec 22, 2009 | Updated: Mar 7, 2013

Last Update: 7. March 2013 09:28

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