Small Angle X-Ray Spredning af proteiner ved brug af S3-Micro SAXS kamera fra Hecus

Emner, der

Indledning
Hvad er SAXS / SWAXS?
Oversigt
Eksperimenterende
Resultater
Konklusion

Indledning

Hecus X-Ray Systems , der blev grundlagt i 1992, er traditionelt specialiseret på innovative systemløsninger til X-Ray nanostruktur analytics. Det stærke fokus på små-vinkel X-ray metoder - Otto-Kratky arv - serverer et bredt fællesskab af forskere og ingeniører, der har brug for SAXS og relaterede teknikker som praktiske og pålidelige værktøjer i deres udfordrende laboratoriepraksis, og som ønsker at bruge teknikker rutinemæssigt.

Hvad er SAXS / SWAXS?

Små-og Wide-Angle X-ray Scattering (S / WAXS) er non-invasive analytiske teknikker til at undersøge strukturen af ​​ikke-krystallinsk eller delvist krystallinske materialer. Både supra-eller makromolekylære domæne samt de interatomare afstandene i små molekyler eller krystaller er undersøgt.

Anvendelsesområder:

• Polymerer
• Flydende krystaller
• Pudder & Cream Formulations
• Biopolymerer
• Biomaterialer
• Katalysatorer
• Nanomaterialer
• Coatings & Film

Oversigt

Små vinkel røntgenspredning af proteiner - eller af nanopartikler i almindelighed - i løsning har vist sig at være en værdifuld metode til deres (nano) strukturelle karakterisering og parametrering som størrelse og form. Den mest fremtrædende parameter er partiklens radius af Gyration Rg, en værdi, som vedrører størrelsen af ​​partiklen, og som let kan udvindes fra den indre del af en SAXS kurve:

I (q) ~ I (0) * exp (-q ² * R _g ² / 3) (1)

med jeg er den spredte intensitet fra prøven, q gensidig spredning vektor (relateret til spredningsvinklen 2θ) og jeg (0) er den ekstrapolerede intensitet til den vinkel nul. Forholdet mellem Q (gensidig metriske enheder, nm ^-1 eller Å ^-1) og 2θ (°, kantede enheder) er givet ved q = 4π (sinθ) / λ, med 2θ blive spredt vinkel i forhold til hændelsen stråle og λ bølgelængden i nm eller Å af de anvendte X-ray stråle.

Eksperimenterende

En løsning af proteinet fremstilles ved at opløse det frysetørrede pulver af protein kvæg (serum) albumin (BSA fra SIGMA kemikalier, St.Louis, MO) i 10 mM PBS-buffer (pH = 8,0). Den endelige koncentration var 15 mg / ml (1,5%). Små-vinkel røntgenspredning (SAXS) målinger af dette protein løsning og de ​​respektive buffer blev udført med en HECUS S3-Micro SAXS kamera vedlagt en Xenocs microbeam levering system (Cu-target, bølgelængde λ = 1,54 Å og FOX3D-optik ), opererede med en effekt på 50 W. Den lodrette Indgangen spalteformede blænden indstillet til 200 μm resulterer i en flux på 1,5 * 10 ⁷ fotoner / s. Den flydende prøver blev fyldt i kvarts kapillærer på 1 mm i diameter og måles ved 20 ° C typisk 2000 S. Før målingerne den relative primære stråleintensitet og X-ray transmission af prøverne blev målt med en pin-diode. Den SAXS-mønstre blev optaget med en lineær 1D position følsom detektor (1024 pixels med 54 μm pixel-bredde) inden for en q-rækkevidde på op til 0,6 Å ^-1. Hændelsen primære stråle blev blokeret af en motoriseret justerbar beamstopper (2 mm W) placeret foran detektoren. Kalibrering af Q-skalaen (konvertere pixelværdier i q-værdier) blev gjort med den pulveriserede Ag-behenate som har en kalibreret d-afstand på 58,38 A. Rådata behandling af spredning kurver (baggrund subtraktion efter normalisering) blev udført med de primære data evalueringsprogram EasySWAXS ( HECUS ) og de ​​behandlede data blev efterfølgende analyseret med programmet pakken ATSAS 2.3. (D. Svergun, EMBL, Hamborg).

Resultater

I Fig.1 den indre del af SAXS kurver for BSA i en buffer (I (q) _s) og buffer (I (q), _b) er vist. Relativ primære stråleintensitet og eksponeringstiden var de samme i begge målinger derfor korrigeres for baggrund var simpelthen gjort ved subtraktion og normalisere af deres transmissions-T _s og T _b, hhv.

I (q) = I (q) _s / T _s - I (q) _b / T _b (2)

Generelt for fortyndet protein løsninger transmission af prøveopløsningen og buffer vil være næsten den samme, i dette særlige tilfælde Ts og tuberkulose var 0,32.

Figur 1. SAXS-kurver BSA 1,5% i buffer (rød), den buffer (grøn) og BSA-buffer (blå), zoomes ind i den inderste del (0 <q <0,2 Å ^-1).

Figur 2. Guinier-plot af SAXS kurven for BSA 1,5%. En værdi på 29,2 Å til F _g er indhentet fra skråningen inden de viste q-grænser Q _min og Q _max på 0,018 <q <0,05 A ^-1, med R _g * q _max være 1,5.

Fig 2. viser SAXS-kurve på 1,5% BSA plottet i den lineariserede form af ligning 2, den såkaldte Guinierplot ln (I (q)) vs q ^2. Den lineære hældning er direkte proportional med R _g ^2, hvilket resulterer i en R _g værdi på 29,2 ± 0,3 A til partikel.

Disse korrigeres for baggrund SAXS data i reciprokke rum er blevet fouriertransformed i real-space, der anvender programmet GNOM 4,5 (ATSAS pakke). Den eneste input parameter for denne procedure er q _min og q _max værdier af SAXS-kurve, og a-priori anslået _D-max værdi, en maksimal størrelse, værdi op til hvilke real-rum-funktionen er ved at blive beregnet. Estimering af _D-max er forbundet med de tilgængelige q _min værdi af spredning kurven ved Q _min <π / D _max. Som et resultat, vi får de virkelige rum-funktion de såkaldte P (R)-funktion eller distance-fordelingsfunktion (se Fig.3), som er karakteristisk for partiklens form, størrelse og interne elektron tæthed homogenitet.

Figur 3. Distance fordelingsfunktion på 1,5% BSA i opløsning fås fra SAXS-kurve i q-sortiment af 0,026 <q <0,3 A ^-1 ved hjælp af programmet GNOM. Den maksimale partikelstørrelse er ca 100 A (hvor funktionen nærmer sig 0). En værdi på 29,3 ± 0,6 Å for Rg blev indhentet fra P (R)-funktion, som er stort set den samme som den blev opnået uafhængigt af Guinier-plot i reciprokke rum.

En lav opløsning facon simulering af SAXS-dataene blev gjort anvender programmet DAMMIN (ATSAS 2,3 pakke). Dette program forsøger at finde en 3-dimensionelle form af en vis algoritme ved at søge en formet objekt, hvis teoretisk beregnet spredning kurve passer til eksperimentelt opnået en. Ingen a-priori antagelser blev foretaget. Fig. 4 viser resultatet af en af ​​disse løb. Det skal understreges, at den opnåede model er en lav rumlig opløsning og er kun én af mange mulige modeller, som passer til de eksperimentelle spredning kurve i eksperimentelt begrænsede Q-range. Den sædvanlige procedure nu ville være at udføre mange kørsler med formen simuleringer på samme eksperimentelle SAXS-kurve, fordi hver kørsel resulterer i en lidt anden model form. En 'gennemsnit' model kan derefter udvindes ved at gøre en rumlig gennemsnit over alle beregnede modeller.

Figur 4. Shape simulering af BSA lav opløsning strukturen fra SAXS-kurve ved hjælp af programmet DAMMIN (et løb). De åbne cirkler (blå) er de eksperimentelle SAXS-data, den grønne linje (sammenfaldende med den røde, derfor ikke synlig) er monteret SAXS-kurve fra GNOM og den røde linje repræsenterer den simulerede SAXS-kurve fra den viste model i den højre del af figuren.

Konklusion

En vurdering af proteinets størrelse og form kan hurtigt opnås med S3-micro SAXS system ved hjælp af et protein opløsning af 1 - 2%. Men for en mere præcis vurdering af disse parametre lavere koncentrationer er nødvendige. Normalt dette sker i en koncentration serie eksperiment ved måling af SAXS-kurver i forskellige (og lavere) protein koncentrationer og ekstrapolere SAXScurves derefter til nul-koncentration.

Kilde: Hecus X-Ray Systems

For mere information om denne kilde kan du besøge Hecus X-Ray Systems .