Pequeno ângulo de espalhamento de Raios-X de proteínas usando S3-Micro Câmera de SAXS Hecus

Temas Abordados

Introdução
O que é SAXS / SWAXS?
Visão global
Experimental
Resultados
Conclusão

Introdução

Hecus X-Ray Sistemas , fundada em 1992, é tradicionalmente especializada em soluções de sistemas inovadores para análise de Raio-X nanoestrutura. O forte foco no pequeno ângulo métodos de raios X - o património Otto-Kratky - serve a uma ampla comunidade de pesquisadores e engenheiros, que precisam de SAXS e técnicas relacionadas como ferramentas práticas e de confiança em suas práticas de laboratório desafiador, e que querem usar o técnicas rotineiramente.

O que é SAXS / SWAXS?

De pequeno e grande-angular de espalhamento de raios-X (S / WAXS) são técnicas não-invasivas de análise para investigar a estrutura dos materiais não-cristalinos ou parcialmente cristalina. Tanto o domínio do supra-ou macromolecular, bem como as distâncias interatômicas nas moléculas de cristais pequenos ou são investigados.

Campos de aplicação:

• Polímeros
• Cristais Líquidos
• Formulações em pó e creme
• Biopolímeros
• Biomateriais
• Catalisadores
• Nanomateriais
• Coatings & Films

Visão global

Pequeno ângulo de espalhamento de raios-X de proteínas - ou de nanopartículas em geral - em solução tem provado ser um método valioso para a sua caracterização (nano) estruturais e parametrização, como tamanho e forma. O parâmetro mais importante é o raio da partícula de Rg giro, um valor que se relaciona com o tamanho da partícula e que pode ser facilmente extraído da parte interna de uma curva de SAXS:

I (q) ~ I (0) * exp (-q ² * R _g ^03/02) (1)

com eu sendo a intensidade espalhada a partir da amostra, q o vetor de espalhamento recíproca (relacionado com o ângulo de espalhamento 2θ) e I (0) sendo a intensidade extrapolados para o zero ângulo. A relação entre q (recíproca unidades métricas, nm ^-1 ou Å ^-1) e 2θ (°, as unidades angular) é dada por q = 4π (sinθ) λ /, com 2θ sendo o ângulo de espalhamento com relação ao feixe incidente e λ o comprimento de onda em nm ou Å do utilizado feixe de raios-X.

Experimental

A solução da proteína preparada dissolvendo o pó liofilizado da proteína bovina (soro) albumina (BSA da SIGMA produtos químicos, St.Louis, MO) em 10 mM PBS-tampão (pH = 8,0). A concentração final foi 15 mg / ml (1,5%). Pequeno ângulo de espalhamento de raios-X (SAXS) medições desta solução de proteína e os respectivos tampão foi realizado com um HECUS S3-Micro câmera SAXS anexado um sistema de entrega de micro Xenocs (Cu-alvo, comprimento de onda λ = 1,54 Å e FOX3D óptica ), operando a uma potência de 50 W. abertura de fenda vertical de entrada foi definida para 200 mM, resultando em um fluxo de 1,5 * 10 ⁷ fótons / s. As amostras líquidas foram acondicionados em vasos capilares de quartzo de 1 mm de diâmetro e medidos a 20 ° C para 2000 normalmente s. Antes de as medidas em relação a intensidade do feixe primário e da transmissão de raios-X das amostras foi medida com um pino-diodo. Os padrões de SAXS foram gravadas com um detector linear 1D sensível à posição (1024 pixels com 54 mM de pixels de largura) dentro de um q-range até 0,6 Å ^-1. O feixe incidente primário foi bloqueado por um beamstopper motorizadas regulável (2 mm W), localizada em frente ao detector. Calibração do q escala (convertendo os valores de pixel em q-valores) foi feito com o pó Ag-behenate que tem uma calibrada d espaçamento de 58,38 dados A. Raw processamento das curvas de dispersão (subtração de fundo após a normalização) foi feito com os dados primários EasySWAXS avaliação do programa ( HECUS ) e os dados processados ​​foram posteriormente analisadas com o pacote de programas ATSAS 2.3. (D. Svergun, EMBL, Hamburg).

Resultados

Na Fig.1 a parte interna das curvas de SAXS de BSA em tampão (I (q) _s) e do buffer (I (q) _b) são mostrados. Intensidade do feixe em relação primária e tempo de exposição foram os mesmos em ambas as medições, portanto, a correção de fundo era simplesmente feito por subtração e normalizar a sua transmissão por T _s e T _b, respectivamente.

I (q) = I (q) _s / _s T - I (q) _b / T _b (2)

Geralmente, para soluções de proteína diluída a transmissão de solução de amostra e tampão será quase o mesmo, neste caso em particular e Ts Tb foram 0,32.

Figura 1. SAXS-curvas de BSA 1,5% em tampão (vermelho), da reserva (verde) e da BSA-buffer (azul), ampliada para a parte interna (0 <q <0,2 Å ^-1).

Figura 2. Guinier-enredo da curva de SAXS da BSA 1,5%. Um valor de 29,2 Å para R _g foi obtida a partir da inclinação dentro da mostra q-q limites _mínimo e _máximo de 0,018 q <q <0,05 Å ^-1, com R _g * q _max sendo de 1,5.

Fig. 2. mostra a curva de SAXS, de 1,5% BSA plotados na forma do linearizada da equação 2, o chamado Guinierplot ln (I (q)) vs q ^2. A inclinação linear é diretamente proporcional à R _g ^2, resultando em um valor de 29,2 _g R ± 0,3 Å para a partícula.

Estes dados SAXS fundo corrigida no espaço recíproco foram fouriertransformed no espaço real, aplicando o programa GNOM 4.5 (pacote ATSAS). O parâmetro de entrada somente para este procedimento são os q _min e os valores q _max da curva de SAXS e do a-priori estimada D valor _máximo, um valor de tamanho máximo para que a função do espaço real está sendo calculada. A estimativa de D _max está conectado com o valor disponível _min q da curva de espalhamento por q _min <π / D _max. Como resultado obtém-se a verdadeira função de espaço a chamada função p (r) de função ou a distância de distribuição (ver Fig.3), que é característico para a forma da partícula, tamanho e homogeneidade da densidade de elétrons internos.

Figura 3. Distância função distribuição de BSA 1,5% em solução obtida a partir da curva de SAXS-in do q alcance de 0.026 <q <0,3 Å ^-1 usando o GNOM programa. O tamanho máximo de partícula é de aproximadamente 100 Å (onde a função se aproxima de 0). Um valor de 29,3 ± 0,6 Å para Rg foi obtida a partir da (r) p-função, que é basicamente a mesma que foi obtida de forma independente do Guinier-enredo no espaço recíproco.

Uma simulação forma de baixa resolução do SAXS-dados foi feita a aplicação do programa DAMMIN (ATSAS pacote 2.3). Este programa tenta encontrar uma forma 3-dimensional por um determinado algoritmo, procurando um objeto em forma teoricamente cuja curva de espalhamento calculado cabe a uma obtidos experimentalmente. Nenhuma suposição a priori foram feitas. Fig. 4 mostra o resultado de um dos executados tal. Tem que se ressaltar que o modelo obtido é de baixa resolução espacial e é apenas um dos muitos modelos possíveis que se encaixa a curva de espalhamento experimental na experimentalmente limitada q alcance. O procedimento usual agora seria para realizar simulações de várias execuções de forma experimental na mesma curva de SAXS, porque cada execução resulta em uma forma de modelo ligeiramente diferente. Um modelo de "média" pode então ser extraído, fazendo uma média espacial sobre todos os modelos calculados.

Figura 4. Simulação forma da estrutura BSA baixa resolução a partir da curva de SAXS utilizando o programa DAMMIN (uma corrida). Os círculos abertos (azul) são as experimental SAXS-data, a linha verde (coincidindo com o vermelho, portanto, não visível) é o equipado SAXS curva obtida GNOM ea linha vermelha representa a curva de SAXS simulado a partir do modelo apresentado na parte direita da figura.

Conclusão

Uma estimativa do tamanho da proteína e forma podem ser rapidamente obtidos com o sistema de SAXS S3-micro usando uma solução de proteína de 1-2%. No entanto, para uma avaliação mais precisa destes parâmetros concentrações mais baixas são necessárias. Geralmente isso é feito em um experimento série concentração medindo SAXS-curvas em diferentes concentrações (e inferior) de proteína e extrapolando o SAXScurves depois para concentração zero.

Fonte: X-Ray Hecus Sistemas

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