Direkte Sichtbarmachung, Bearbeiten und Zählung von Exosomes Unter Verwendung der Nanoparticle-GleichlaufAnalyse (NTA) von NanoSight

Durch AZoNano

Themen Umfaßt

Einleitung
Exosomes Entdecken und Zählend
Alternative Techniken
Selektivität des Maßes
Zusammenfassung

Einleitung

Microvesicles (gewöhnlich im 100nm zur Reichweite 1um) und die nanovesicles, auch genannt exosomes (30-100nm), wurden zuerst geglaubt, um zellulärer Rückstand zu sein. Jedoch wird es jetzt geschätzt, dass diese Zelle-berechneten Partikel von beträchtlicher Bedeutung sind und eine wichtige Rolle in der Zelle zur Zellnachrichtenübermittlung und -Zellkommunikation spielen.

Ihre Bedeutung ist vor kurzem erkannt geworden, seit es entdeckt wurde, dass sie auf beträchtlich erhöhten Niveaus in einigen Krankheitsbedingungen einschließlich Koronararterienleiden, entzündliche Krankheiten, Präeklampsie, Diabetes und Krebs anwesend sind. Dieses wirft die Frage ihrer direkten Rolle in der Pathogenese sowie ihres möglichen Gebrauches als Biomarkers auf.

Unter solchem Umstand sind exosomes in den beträchtlich höheren Zahlen gewöhnlich anwesend, als microvesicles und während der Prozess der Entstehung dieser Partikel noch das Thema der Debatte ist, ihre höhere Konzentration die Kennzeichnung von diesen Teilchen von möglicher Bedeutung im Hinblick auf früheren und empfindlicheren Befund macht.

NanoSight bietet einen neuen Laser-basierten Nanoparticle an, der Analyseanlage (NTA) Aufspürt, die erlaubt, dass spezifische mikrosomale und exosome Partikel in der Flüssigkeit in der Istzeit direkt und einzeln sichtbar zu machen und gezählt und von, welchem hochauflösenden Teilchengrößeverteilungsprofilen erreicht werden können.

Die Technik ist bedienungsfreundlich kosteneffektiv, schnell, robust, genau und und stellt eine attraktive Alternative oder eine Ergänzung zu vorhandenen Methoden der Nanoparticleanalyse wie Fluss Cytometry, eine Elektronenmikroskopie oder eine Dynamische Lichtstreuung, DLS dar (alias Photon-Wechselbeziehungs-Spektroskopie, PCS).

Exosomes Entdecken und Zählend

Das NanoSight-Instrument bietet einen eindeutigen Einblick in exosomes im Bereich von 50nm - 1000nm an.

Die Technik ist vielseitig und normalerweise einfache Verdünnung ist genügend, die Konzentration von den Partikeln zu messen, die in der Probe vorhanden sind. Zuerst kann die Probe auf das Vorhandensein von größeren Partikeln oder von geansammeltem materiellem (Abbildung 1a) Folgen sichtlich überprüft werden, denen der Benutzer ein Teilchengrößeverteilungsprofil der hohen Auflösung und eine Zählung (im Hinblick auf absolute Zahlkonzentration) der gesehenen Bäschen schnell erzeugen kann (Abbildung 1b).

Abbildung 1. Probe des verdünnten Plättchen-freien Plasmas. A) Ein typisches Bild produziert durch die NanoSight-Technik. Das Bild erlaubt den Benutzern, bestimmte Merkmale über ihre Probe einschließlich Konzentration und Niveau von Polyzerstreubarkeit sofort zu erkennen. B) Teilchengrößeverteilung und berechnete Ausgangskonzentration von der Probe.

Alternative Techniken

Historisch sind einige Techniken verwendet worden, um microvesicles und nanovesicles mit mehr Techniken zu kennzeichnen, die für die Mikro sortierten Partikel erhältlich sind.

Analytische Techniken:

Vermutlich ist das geläufigste von diesen Fluss Cytometry. Typischer Handelsfluß Cytometry hat eine niedrigere Größengrenze auf um 300nm an, welchem Punkt das Signal vom GrundlinienGeräuschpegel ununterscheidbar ist. Während diese Nachweisgrenze mit dem Gebrauch von Leuchtstoffschildern ausgedehnt werden kann, an den niedrigeren Größen ist die Fähigkeit, solche Partikel genau zu sortieren schwer begrenzt.

Die Dynamische Lichtstreuung (DLS) ist auch in dieser Anwendung verwendet worden, aber seiend ein Ensemblemaß, enthalten die Ergebnisse entweder eine einfache z-durchschnittliche (die Intensität belastet) Teilchengröße und Polyzerstreubarkeit oder ein sehr Begrenztauflösung Teilchengrößeverteilungsprofil. Entscheidend sind keine Partikelkonzentrationsinformationen erhältlich und DLS kann Leuchtstoff-beschriftete Partikel nicht messen.

Elektronenmikroskopie ist ein nützliches Forschungshilfsmittel für das Studieren mikro- und nanovesicles aber auf Kosten von Kapital und Verwaltungskosten, Probenaufbereitungs- und Durchsatzzeit und Beispielintegrität nach Probenaufbereitung.

Selektivität des Maßes

Während es häufig ausreichend ist, bloß zu bestimmen, ob Partikel einer bestimmten Größe oder der Größenreichweite in einer Probe anwesend sind, ist es häufig viel wichtiger, spezifische Unterbevölkerungen von Partikeln innerhalb der Probe zu kennzeichnen und zu unterscheiden. Die NanoSight-Technik ist zu solche Bevölkerungen den Gebrauch von Antikörper-vermittelter Leuchtstoffkennzeichnung selektiv durch zum Beispiel analysieren fähig. Dieser Anflug erlaubt dem Benutzer, nur die spezifischen nanoparticles, an die der Leuchtstoff-beschriftete Antikörper, die unspezifischen Partikeln des Hintergrundes zu entdecken bindet, zu analysieren und zu zählen, die durch den Gebrauch der passenden optischen Filter ausgeschlossen werden. Während eine Reichweite der fluorophores verwendet werden kann, ist es günstig, Hochleistungsfähigkeit, hohe Schilder des Stabilitätsquantums-Punktes einzusetzen (QDot®) für beste Ergebnisse.

Dieses wird in der Abbildung 2A demonstriert, die ein einzelnes Videofeld der Fluoreszenzleuchte ausgestrahlt von den Quantumspunkten zeigt, die mit einem NanoSight-Instrument erregt werden, das mit einer blauen Laserdiode befestigt wird. Diese Quantumspunkte wurden verwendet, um einen Antikörper (Besonderen NDOG II) zum Ziel Biomarker vorhanden auf einem syncytiotrophoblast microvesicle (STBM) zu beschriften.

Abbildung 2. A) Fluoreszenzbild von den Quantumspunkten befestigt über Antikörper zu STBM-Partikeln. B) Teilchengrößeverteilungen vom Streulicht (blau), vom korrekten Antikörper (rot) und vom falschen (Steuer) Antikörper (Grün). Beachten Sie den Zahlkonzentrations-Vertikalenschwerpunkt.

Stellen Sie 2B das Korngrößenverteilungsdarstellen der Shows drei dar: i) alle Partikel vorhanden in der STBM-Probe (blaue Zeile) wie durch (nichtfluoreszierende) Leuchtenstreuung entdeckt, II) zu denen die Partikel der Leuchtstoff QDot-beschriftete Antikörper NDOG II speziell gesprungen waren, als Maßnahme unter Fluoreszenzmodus (rote Zeile) und iii) eine Regelung (Grüne Grenze) einen ähnlich beschrifteten QDot-beschrifteten Antikörper ohne Affinität enthalten dem Ziel Biomarker auf dem STBM (auch gemessen im Fluoreszenzmodus). Dieses zeigt, dass die Mehrheit der Partikel, die in der Probe vorhanden sind, erfolgreich und speziell durch den STBM-spezifischen Q-Punkt-NDOG II Antikörper beschriftet wurden und dass die Regelung erfolgreich ein sehr niedriges Signal zeigte.

Zusammenfassung

Die NanoSight-Technik kann erfolgreich sortieren und microvesicles und exosomes bei einer niedrigen Konzentration zu zählen und, wenn es in Verbindung mit Leuchtstoffschildern verwendet wird, kann spezifische Baumuster des Partikels innerhalb einer komplexen Probe selektiv bestimmen und analysieren.

Diese Informationen sind Ursprungs- angepasst gewesen, wiederholt und von den Materialien, die von NanoSight bereitgestellt werden.

Zu mehr Information besuchen Sie bitte NanoSight.

Date Added: Oct 17, 2010 | Updated: Mar 7, 2013

Last Update: 7. March 2013 11:32

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit