Visualización, Apresto y el Contar Directos de Exosomes Usando Análisis Que Sigue Su Trayectoria del Nanoparticle (NTA) de NanoSight

Por AZoNano

Temas Revestidos

Introducción
Detectando y Contando Exosomes
Técnicas Alternativas
Selectividad de la Medición
Resumen

Introducción

Microvesicles (típicamente en el 100nm al rango 1um) y los nanovesicles, también llamados los exosomes (30-100nm), fueron creídos inicialmente para ser escombros celulares. Sin Embargo ahora se aprecia que estas partículas célula-derivadas son de importancia importante y desempeñan un papel importante en célula a la comunicación de la célula y a la transmisión de señales de la célula.

Su importancia recientemente se ha reconocido desde que fue descubierto que están presentes en los niveles importante elevados en varias condiciones de las enfermedades incluyendo enfermedad de la arteria coronaria, enfermedades inflamatorias, pre-eclampsia, diabetes y cáncer. Esto plantea la cuestión de su papel directo en patogenesia así como de su uso posible como biomarkers.

En tal condición económica, los exosomes están típicamente presentes en números importante más elevados que los microvesicles y mientras que el proceso de la formación de estas partículas siguen siendo el tema del discusión, su concentración más alta hace la caracterización de estas partículas más pequeñas de la importancia potencial en términos de detección anterior y más sensible.

NanoSight ofrece un nuevo Nanoparticle laser-basado Que Sigue Su Trayectoria el sistema (NTA) de Análisis que permite que las partículas microsomales y exosome específicas visualizar directamente e individualmente y contado en líquido en tiempo real y qué perfiles de alta resolución de la distribución dimensional de partícula pueden ser obtenidos.

La técnica es fácil de utilizar, rápida, robusta, exacta y de poco costo, representando una opción atractiva o un complemento a los métodos existentes de análisis del nanoparticle tales como Cytometry de Flujo, una Microscopia Electrónica O una Dispersión Luminosa Dinámica, DLS (también conocido como Espectroscopia de la Correlación del Fotón, PCS).

Detectando y Contando Exosomes

El instrumento de NanoSight ofrece un discernimiento único en exosomes en el rango de 50nm - 1000nm.

La técnica es versátil y la dilución normalmente simple es suficiente medir la concentración de partículas presentes en la muestra. La muestra se puede revisar Inicialmente visualmente para la presencia de partículas más grandes o (Figura 1a) de siguiente material agregado que el utilizador pueda rápidamente generar un perfil de alta resolución de la distribución dimensional de partícula y una cuenta (en términos de concentración de número absoluta) de las vesículas vistas (Figura 1b).

Cuadro 1. Muestra del plasma plaqueta-libre diluida. A) Una imagen típica producida por la técnica de NanoSight. La imagen permite que los utilizadores reconozcan inmediatamente ciertas características sobre su muestra incluyendo la concentración y el nivel de polidispersidad. B) Distribución dimensional de Partícula y concentración original calculada de la muestra.

Técnicas Alternativas

Históricamente, varias técnicas se han utilizado para caracterizar microvesicles y nanovesicles con más técnicas que estaban disponibles para las partículas clasificadas micrófono.

Técnicas Analíticas:

El más común de éstos es Probablemente cytometry de Flujo. El cytometry de flujo Comercial típico tiene un límite más inferior de la talla alrededor de 300nm en qué punta es indistinguible la señal del nivel de ruidos de la línea de fondo. Mientras Que este límite de detección se puede ampliar con el uso de escrituras de la etiqueta fluorescentes, en tallas más inferiores la capacidad de clasificar exactamente tales partículas es seriamente limitada.

La Dispersión Luminosa Dinámica (DLS) también se ha utilizado en esta aplicación pero siendo una medición del conjunto, los resultados comprenden (intensidad cargada) una talla de partícula z-media simple y polidispersidad o mismo un perfil de la distribución dimensional de partícula de la limitado-resolución. Crucial, no hay información de la concentración de la partícula disponible y DLS no puede medir partículas fluorescente-etiqueta.

La microscopia electrónica es una herramienta útil de la investigación para estudiar micro y los nanovesicles pero a expensas de costos de capital y corrientes, del tiempo de la preparación de la muestra y de la producción y de la integridad de la muestra después de la preparación de la muestra.

Selectividad de la Medición

Mientras Que es con frecuencia adecuada determinar simplemente si las partículas de una cierta talla o gama de tallas están presentes en una muestra, es a menudo mucho más importante determinar y discriminar subpoblaciones específicas de partículas dentro de la muestra. La técnica de NanoSight es capaz selectivamente de analizar tales poblaciones a través, por ejemplo, el uso de la etiqueta fluorescente anticuerpo-mediada. Esta aproximación permite que el utilizador detecte, analice y cuente solamente los nanoparticles específicos a los cuales el anticuerpo fluorescente-etiqueta ata, macropartículas no específicas de los antecedentes que son excluidas con el uso de filtros ópticos apropiados. Mientras Que un rango de fluorophores puede ser utilizado, es ventajoso emplear las escrituras de la etiqueta de gran eficacia, altas del punto del quantum de la estabilidad (QDot®) para los mejores resultados.

Esto se demuestra en la Figura 2A que muestra un único bastidor video de la luz de la fluorescencia emitido de los puntos del quantum emocionados con un instrumento de NanoSight ajustado con un diodo láser azul. Estos puntos del quantum fueron utilizados para etiqueta un anticuerpo (específico de NDOG II) al biomarker de la meta presente en un microvesicle del syncytiotrophoblast (STBM).

Cuadro 2. A) imagen de la Fluorescencia de los puntos del quantum asociados vía el anticuerpo a las partículas de STBM. B) Distribuciones dimensionales de Partícula de la luz dispersa (azul), del anticuerpo correcto (rojo) y del anticuerpo incorrecto (del mando) (verde). Observe el eje de la vertical de la concentración de número.

Figure 2B mostrar de las distribuciones dimensionales de las demostraciones tres: i) todas las partículas presentes en la muestra de STBM (línea azul) según lo detectado por la dispersión (no fluorescente) de la luz, ii) las partículas a las cuales el anticuerpo QDot-etiqueta fluorescente de NDOG II habían limitado específicamente, como dimensión bajo modo de la fluorescencia (línea roja), e iii) un mando (Línea Verde) que comprende un anticuerpo QDot-etiqueta semejantemente etiqueta sin afinidad al biomarker de la meta en el STBM (también medido en modo de la fluorescencia). Esto muestra que la mayoría de las partículas presentes en la muestra etiqueta con éxito y específicamente por el anticuerpo STBM-específico del Q-Punto-NDOG II y que el mando mostró con éxito una señal muy inferior.

Resumen

La técnica de NanoSight puede clasificar con éxito y contar microvesicles y exosomes en una concentración inferior y, cuando está utilizado conjuntamente con escrituras de la etiqueta fluorescentes, puede determinar y analizar selectivamente tipos específicos de partícula dentro de una muestra compleja.

Esta información ha sido originaria, revisada y adaptada de los materiales proporcionados por NanoSight.

Para más información visite por favor NanoSight.

Date Added: Oct 17, 2010 | Updated: Mar 7, 2013

Last Update: 7. March 2013 11:34

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