Visualisation, Calibrage et Compte Directs d'Exosomes Utilisant l'Analyse de Cheminement de Nanoparticle (NTA) de NanoSight

Par AZoNano

Sujets Couverts

Introduction
Trouvant et Comptant Exosomes
Techniques Alternatives
Sélectivité de la Mesure
Résumé

Introduction

On a au commencement pensé que Microvesicles (type dans le 100nm à domaine 1um) et nanovesicles, aussi les exosomes appelés (30-100nm), sont les saletés cellulaires. Cependant on l'apprécie maintenant que ces particules cellule-dérivées sont d'importance significative et jouent un rôle majeur en cellule à la transmission de cellules et à la signalisation de cellules.

Leur importance est récent devenue décelée depuis qu'on l'a découvert qu'elles sont présentes de manière significative aux niveaux élevés en un certain nombre de conditions des maladies comprenant la maladie coronarienne, les maladies inflammatoires, la pré-éclampsie, le diabète et le cancer. Ceci soulève la question de leur rôle direct dans la pathogénie ainsi que de leur utilisation possible comme biomarqueurs.

Dans une telle circonstance, les exosomes sont en général présents dans des numéros sensiblement plus élevés que les microvesicles et tandis que le procédé de la formation de ces particules est toujours le sujet de la discussion, leur concentration plus élevée effectue la caractérisation de ces plus petites particules d'importance potentielle en termes de dépistage plus précoce et plus sensible.

NanoSight offre un Nanoparticle basé sur le laser neuf Cheminant le système (NTA) d'Analyse qui permet aux particules microsomiques et exosome particulières concevoir directement et individuellement et compter dans le liquide en temps réel et à partir de le quel profils à haute résolution de distribution de dimension particulaire peuvent être obtenus.

La technique est facile à utiliser, rapide, robuste, précise et rentable, représentant une alternative séduisante ou un complément aux méthodes existantes d'analyse de nanoparticle telles que la Cytométrie de Flux, la Microscopie Électronique ou la Dispersion de la Lumière Dynamique, DLS (également connu sous le nom de Spectroscopie de Corrélation de Photon, PCS).

Trouvant et Comptant Exosomes

L'instrument de NanoSight offre une seule analyse dans des exosomes de l'ordre de 50nm - 1000nm.

La technique est versatile et la dilution normalement simple est suffisante pour mesurer la concentration des particules actuelles dans l'échantillon. Au Commencement l'échantillon peut être visuellement examiné pour assurer la présence de plus grandes particules ou (Figure 1a) de suivre matériel totalisé que l'utilisateur peut rapidement produire d'un profil de haute résolution de distribution de dimension particulaire et d'un compte (en termes de concentration de numéro absolue) des vésicules vues (Figure 1B).

Le Schéma 1. Échantillon du plasma sans plaquette dilué. A) Une image typique produite par la technique de NanoSight. L'image permet aux utilisateurs d'identifier immédiatement certaines caractéristiques techniques au sujet de leur échantillon comprenant la concentration et le niveau de la multidispersion. B) Distribution de dimension particulaire et concentration initiale prévue de l'échantillon.

Techniques Alternatives

Historiquement, un certain nombre de techniques ont été employées pour caractériser des microvesicles et des nanovesicles avec plus de techniques étant disponibles aux particules classées par micro.

Techniques Analytiques :

Le plus commun de ces derniers est Probablement Cytométrie de flux. La cytométrie de flux Commerciale particulière a une limite inférieure de taille de autour de 300nm à quelle remarque le signe est imperceptible du niveau sonore de spécification de base. Tandis Que cette limite de détection peut être étendue avec l'utilisation des étiquettes fluorescentes, aux tailles inférieures la capacité de classer exactement de telles particules est sévèrement limitée.

La Dispersion de la Lumière Dynamique (DLS) a été également utilisée dans cette application mais étant une mesure d'ensemble, les résultats comportent (intensité pesée) une dimension particulaire z-moyenne simple et multidispersion ou très un profil de distribution de dimension particulaire de limité-définition. Crucialement, aucune information de concentration de particules n'est disponible et DLS ne peut pas mesurer les particules fluorescent-étiquetées.

La Microscopie électronique est un outil de recherches utile pour l'étude micro et les nanovesicles mais aux dépens des coûts capitaux et de fonctionnement, de temps de préparation des échantillons et de débit et d'intégrité d'échantillon après préparation des échantillons.

Sélectivité de la Mesure

Tandis Qu'elle est fréquemment adéquate pour déterminer simplement si les particules d'une certaine taille ou classe de grandeur sont présentes dans un échantillon, il est souvent beaucoup plus important de recenser et distinguer les sous-populations particulières des particules dans l'échantillon. La technique de NanoSight est capable d'analyser sélecteur de telles populations, par exemple, l'utilisation de l'écriture de labels fluorescente anticorps-assistée. Cet élan permet à l'utilisateur de trouver, analyser et compter seulement les nanoparticles particuliers auxquels l'anticorps fluorescent-étiqueté grippe, substances particulaires non spécifiques de mouvement propre étant exclues par l'utilisation des filtres optiques appropriés. Tandis Qu'un domaine des fluorophores peut être utilisé, il est avantageux d'utiliser les étiquettes à haut rendement et de forte stabilité de point de tranche de temps (QDot®) pour les meilleurs résultats.

Ceci est expliqué dans la Figure 2A qui affiche une image vidéo unique de la lumière de fluorescence émise des points de tranche de temps excités avec un instrument de NanoSight équipé d'une diode laser bleue. Ces points de tranche de temps ont été employés pour étiqueter un anticorps (détail de NDOG II) au biomarqueur d'objectif actuel sur un microvesicle de syncytiotrophoblast (STBM).

Le Schéma 2. A) image de Fluorescence des points de tranche de temps fixés par l'intermédiaire de l'anticorps aux particules de STBM. B) Distributions de dimension particulaire de la lumière dispersée (bleue), de l'anticorps correct (rouge) et de l'anticorps incorrect (de contrôle) (vert). Notez l'axe de verticale de concentration de numéro.

Figure 2B afficher de distributions de grandeurs des expositions trois : i) toutes les particules actuelles dans l'échantillon de STBM (ligne bleue) comme trouvé par la dispersion (non fluorescente) de la lumière, ii) les particules auxquelles l'anticorps QDot-étiqueté fluorescent de NDOG II avaient lié particulièrement, comme mesure sous le mode de fluorescence (ligne rouge), et iii) un contrôle (Ligne Verte) comportant un anticorps QDot-étiqueté assimilé étiqueté sans l'affinité au biomarqueur d'objectif sur le STBM (également mesuré en mode de fluorescence). Ceci prouve que la majorité des particules actuelles dans l'échantillon avec succès et particulièrement ont été étiquetées par l'anticorps STBM-particulier du Q-Point-NDOG II et que le contrôle a avec succès affiché un signe très faible.

Résumé

La technique de NanoSight peut avec succès classer et compter des microvesicles et des exosomes à une concentration faible et, une fois utilisé conjointement avec les étiquettes fluorescentes, peut sélecteur déterminer et analyser les types particuliers de particule dans un échantillon complexe.

Cette information a été originaire, révisée et adaptée des matériaux fournis par NanoSight.

Pour plus d'information visitez s'il vous plaît NanoSight.

Date Added: Oct 17, 2010 | Updated: Mar 7, 2013

Last Update: 7. March 2013 11:32

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