Visualizzazione Diretta, Incollatura e Conteggio di Exosomes Facendo Uso di Analisi Tenente La Carreggiata di Nanoparticella (NTA) da NanoSight

Da AZoNano

Argomenti Coperti

Introduzione
Individuando e Contando Exosomes
Tecniche Alternative
Selettività della Misura
Riassunto

Introduzione

Microvesicles (tipicamente nel 100nm ad intervallo 1um) e i nanovesicles, anche chiamati exosomes (30-100nm), inizialmente sono stati creduti per essere detriti cellulari. Tuttavia ora è apprezzato che queste particelle cella-derivate siano di importanza significativa e svolgano un ruolo importante sia in cella alla comunicazione delle cellule che alla segnalazione delle cellule.

La Loro importanza recentemente è stato riconosciuta da quando è stato scoperto che sono presenti ai livelli significativamente elevati in una serie di termini di malattie compreso la coronaropatia, le malattie infiammatorie, l'pre-eclampsia, il diabete ed il cancro. Ciò solleva il problema del loro ruolo diretto in patogenesi come pure del loro uso possibile come biomarcatori.

In tale circostanza, i exosomes sono in genere presenti nei numeri significativamente più alti che i microvesicles e mentre il trattamento della formazione di queste particelle è ancora l'argomento del dibattito, la loro più alta concentrazione fa la caratterizzazione di queste più piccole particelle di importanza potenziale in termini di rilevazione più iniziale e più sensibile.

NanoSight offre una nuova Nanoparticella basata sul laser che Tiene La Carreggiata il sistema (NTA) di Analisi che permette che le particelle microsomiche e exosome specifiche siano liquido direttamente e determinato visualizzato e incluso in tempo reale e dal quale profili ad alta definizione di distribuzione di dimensione delle particelle possono essere ottenuti.

La tecnica è di facile impiego, veloce, robusta, accurata e redditizia, rappresentando un'alternativa attraente o un complemento ai metodi attuali di analisi di nanoparticella quale Citometria a Flusso, una Microscopia Elettronica O uno Scattering Leggero Dinamico, DLS (anche conosciuto come la Spettroscopia di Correlazione del Fotone, PCS).

Individuando e Contando Exosomes

Lo strumento di NanoSight offre una comprensione unica nei exosomes nell'ordine di 50nm - 1000nm.

La tecnica è versatile e la diluizione normalmente semplice è sufficiente per misurare la concentrazione di particelle presenti nel campione. Inizialmente il campione può essere ispezionato visivamente per la presenza di più grandi particelle o (Figura 1a) di seguire materiale cumulato che l'utente può rapido generare un profilo di alta risoluzione di distribuzione di dimensione delle particelle e un conteggio (in termini di concentrazione di numero assoluta) delle vescicole vedute (Figura 1b).

Figura 1. Campione di plasma senza piastrina diluito. A) Un'immagine tipica prodotta dalla tecnica di NanoSight. L'immagine permette che gli utenti immediatamente riconoscano determinate funzionalità circa il loro campione compreso concentrazione ed il livello di multidispersione. B) Distribuzione di dimensione delle Particelle e concentrazione originale calcolata dal campione.

Tecniche Alternative

Storicamente, una serie di tecniche sono state usate per caratterizzare i microvesicles e i nanovesicles con più tecniche che sono disponibili alle particelle graduate micro.

Tecniche Analitiche:

Probabilmente il più comune di questi è Citometria a flusso. La citometria a flusso Commerciale tipica ha un limite più basso di dimensione intorno a 300nm a quale punto il segnale è indistinguibile dal livello acustico del riferimento. Mentre questo limite di segnalazione può essere esteso con l'uso dei contrassegni fluorescenti, alle dimensioni più basse la capacità di graduare esattamente tali particelle secondo la misura è severamente limitata.

Lo Scattering Leggero Dinamico (DLS) egualmente è stato utilizzato in questa applicazione ma essendo una misura dell'insieme, i risultati comprendono (intensità pesata) una dimensione delle particelle z-media semplice e la multidispersione o molto un profilo di distribuzione di dimensione delle particelle di limitato-risoluzione. Fondamentalmente, non ci sono informazioni di concentrazione della particella disponibili e DLS non può misurare le particelle fluorescente-contrassegnate.

La microscopia elettronica è uno strumento utile della ricerca per lo studio micro- e nanovesicles ma a scapito dei costi di esercizio e capitali, del preparato del campione e del tempo di lavorazione e dell'integrità del campione dopo il preparato del campione.

Selettività della Misura

Mentre è frequentemente adeguata determinare soltanto se le particelle di certa dimensione o intervallo di grandezza sono presenti in un campione, è spesso molto più importante identificare e discriminare le sottopopolazioni specifiche delle particelle all'interno del campione. La tecnica di NanoSight è capace selettivamente di analizzare tali popolazioni da parte a parte, per esempio, l'uso di contrassegno fluorescente anticorpo-mediato. Questo approccio permette che l'utente individui, analizzi e conti soltanto le nanoparticelle specifiche a cui l'anticorpo fluorescente-contrassegnato lega, particelle non specifiche di sfondo che si sono escluse con l'uso dei filtri ottici appropriati. Mentre un intervallo dei fluorophores può essere usato, è vantaggioso impiegare il alto-risparmio di temi, alti contrassegni del punto di quantum della stabilità (QDot®) per i migliori risultati.

Ciò è dimostrata nella la Figura 2A che mostra un singolo video fotogramma dell'indicatore luminoso della fluorescenza emesso dai punti di quantum eccitati con uno strumento di NanoSight misura con un diodo laser blu. Questi punti di quantum sono stati usati per contrassegnare un anticorpo (NDOG II) specifico al biomarcatore dell'obiettivo presente su un microvesicle dello syncytiotrophoblast (STBM).

Figura 2. A) Immagine di Fluorescenza dai punti di quantum fissati via l'anticorpo alle particelle di STBM. B) Distribuzioni di dimensione delle Particelle da indicatore luminoso sparso (blu), dall'anticorpo corretto (rosso) e dall'anticorpo sbagliato (di controllo) (verde). Noti l'asse di verticale di concentrazione di numero.

Calcoli 2B la mostra di distribuzioni per ampiezza di manifestazioni tre: i) tutte le particelle presenti nel campione di STBM (linea blu) come individuato dallo spargimento (non fluorescente) dell'indicatore luminoso, ii) le particelle a cui l'anticorpo QDot-contrassegnato fluorescente di NDOG II avevano limitato specificamente, come misura nell'ambito del modo della fluorescenza (linea rossa) ed iii) un controllo (linea verde) che comprende un anticorpo QDot-contrassegnato similmente contrassegnato senza l'affinità al biomarcatore dell'obiettivo sullo STBM (anche misurato nel modo di fluorescenza). Ciò indica che la maggior parte delle particelle presenti nel campione con successo e specificamente è stata contrassegnata dall'anticorpo STBM-specifico del Q-Punto-NDOG II e che il controllo ha mostrato con successo un segnale molto basso.

Riassunto

La tecnica di NanoSight può graduare con successo e contare sia i microvesicles che i exosomes ad una concentrazione bassa e, una volta usato insieme con i contrassegni fluorescenti, può determinare ed analizzare selettivamente i tipi specifici di particelle all'interno di un campione complesso.

Questi informazioni sono state originarie, esaminate ed adattate dai materiali forniti da NanoSight.

Per più informazioni visualizzi prego NanoSight.

Date Added: Oct 17, 2010 | Updated: Mar 7, 2013

Last Update: 7. March 2013 11:32

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit