Visualisation, Cola e Contagem Directos de Exosomes Usando a Análise de Seguimento do Nanoparticle (NTA) de NanoSight

Por AZoNano

Assuntos Cobertos

Introdução
Detectando e Contando Exosomes
Técnicas Alternativas
Selectividade da Medida
Sumário

Introdução

Microvesicles (tipicamente no 100nm à escala 1um) e os nanovesicles, igualmente chamados os exosomes (30-100nm), foram acreditados inicialmente para ser restos celulares. Contudo aprecia-se agora que estas partículas pilha-derivadas são da importância significativa e jogam um papel importante na pilha a uma comunicação da pilha e à sinalização da pilha.

Sua importância tem-se tornado recentemente reconhecida desde que se descobriu que estam presente a níveis significativamente elevados em um número de condições das doenças que incluem a doença arterial coronária, doenças inflamatórios, pre-eclampsia, diabetes e cancro. Isto levanta a pergunta de seu papel directo na patogénese assim como de seu uso possível como biomarkers.

Em tal circunstância, os exosomes estão tipicamente actuais em uns números significativamente mais altos do que os microvesicles e enquanto o processo da formação destas partículas são ainda o assunto do debate, sua concentração mais alta faz a caracterização destas partículas menores da importância potencial em termos de uma detecção mais adiantada e mais sensível.

NanoSight oferece um Nanoparticle baseado no laser novo que Segue o sistema (NTA) de Análise que permitem que as partículas microsomal e exosome específicas para visualizar directamente e individualmente e contar no líquido no tempo real e do que perfis de alta resolução da distribuição de tamanho da partícula podem ser obtidos.

A técnica é fácil de usar, rápida, robusta, exacta e eficaz na redução de custos, representando uma alternativa atractiva ou um complemento aos métodos existentes da análise do nanoparticle tais como o Cytometry de Fluxo, uma Microscopia de Elétron ou uma Dispersão de Luz Dinâmica, DLS (igualmente conhecido como a Espectroscopia da Correlação do Fotão, PCS).

Detectando e Contando Exosomes

O instrumento de NanoSight oferece uma introspecção original em exosomes na escala de 50nm - 1000nm.

A técnica é versátil e a diluição normalmente simples é suficiente para medir a concentração de partículas actuais na amostra. Inicialmente a amostra pode visualmente ser inspeccionada para a presença de partículas maiores ou (Figura 1a) de seguimento material agregado que o usuário pode ràpida gerar um perfil de alta resolução da distribuição de tamanho da partícula e uma contagem (em termos da concentração de número absoluta) das vesículas vistas (Figura 1b).

Figura 1. Amostra do plasma plaqueta-livre diluído. A) Uma imagem típica produzida pela técnica de NanoSight. A imagem permite que os usuários reconheçam imediatamente determinadas características sobre sua amostra que inclui a concentração e o nível de polidispersidade. B) Distribuição de tamanho da Partícula e concentração original calculada da amostra.

Técnicas Alternativas

Historicamente, um número de técnicas foram usadas para caracterizar microvesicles e nanovesicles com mais técnicas que estão disponíveis às partículas feitas sob medida micro.

Técnicas Analíticas:

Provavelmente o mais comum destes é cytometry de Fluxo. O cytometry de fluxo Comercial típico tem um limite mais baixo do tamanho em torno de 300nm em que ponto o sinal é indistinguível do nível de ruído da linha de base. Quando este limite de detecção puder ser estendido com o uso de etiquetas fluorescentes, em uns mais baixos tamanhos a capacidade para fazer sob medida exactamente tais partículas é severamente limitada.

A Dispersão de Luz Dinâmica (DLS) foi usada igualmente nesta aplicação mas sendo uma medida do conjunto, os resultados compreendem (intensidade tornada mais pesada) um tamanho de partícula z-médio simples e polidispersidade ou muito um perfil da distribuição de tamanho da partícula da limitado-definição. Crucial, nenhuma informação da concentração da partícula está disponível e DLS não pode medir partículas fluorescente-etiquetadas.

A microscopia de Elétron é uma ferramenta útil da pesquisa para o estudo micro e os nanovesicles mas às expensas do capital e as despesas, o tempo da preparação da amostra e da produção e a integridade da amostra depois da preparação da amostra.

Selectividade da Medida

Enquanto é freqüentemente adequada determinar meramente se as partículas de alguma tamanho ou escala do tamanho estam presente em uma amostra, é frequentemente muito mais importante identificar e discriminar subpopulações específicas das partículas dentro da amostra. A técnica de NanoSight é capaz selectivamente de analisar tais populações completamente, por exemplo, o uso da rotulagem fluorescente anticorpo-negociada. Esta aproximação permite que o usuário detecte, analise e conte somente os nanoparticles específicos a que o anticorpo fluorescente-etiquetado liga, relativo à partícula ínfima não específicos do fundo que estão sendo excluídos com o uso de filtros ópticos apropriados. Quando uma escala dos fluorophores puder ser usada, é vantajoso empregar as etiquetas de grande eficacia, altas do ponto do quantum da estabilidade (QDot®) para os melhores resultados.

Isto é demonstrado na Figura 2A que mostra um único quadro video da luz da fluorescência emissor dos pontos do quantum entusiasmado com um instrumento de NanoSight cabido com um diodo láser azul. Estes pontos do quantum foram usados para etiquetar um específico do anticorpo (NDOG II) ao biomarker do alvo actual em um microvesicle do syncytiotrophoblast (STBM).

Figura 2. A) imagem da Fluorescência dos pontos do quantum anexados através do anticorpo às partículas de STBM. B) Distribuições de tamanho da Partícula da luz dispersada (azul), do anticorpo correcto (vermelho) e do anticorpo incorrecto (do controle) (verde). Note a linha central do vertical da concentração de número.

Figure 2B mostrar das distribuições de tamanho das mostras três: i) todas as partículas actuais na amostra de STBM (linha azul) como detectado pelo scatter (não-fluorescente) da luz, ii) as partículas a que o anticorpo QDot-etiquetado fluorescente de NDOG II tinha limitado especificamente, como a medida sob o modo da fluorescência (linha vermelha), e iii) um controle (linha verde) que compreende um anticorpo QDot-etiquetado similarmente etiquetado sem a afinidade ao biomarker do alvo no STBM (igualmente medido no modo da fluorescência). Isto mostra que a maioria das partículas actuais na amostra estêve etiquetada com sucesso e especificamente pelo anticorpo STBM-específico do Q-Ponto-NDOG II e que o controle mostrou com sucesso um sinal muito baixo.

Sumário

A técnica de NanoSight pode com sucesso fazer sob medida e contar microvesicles e exosomes em uma baixa concentração e, quando usada conjuntamente com etiquetas fluorescentes, pode selectivamente determinar e analisar tipos específicos de partícula dentro de uma amostra complexa.

Esta informação foi originária, revista e adaptada dos materiais fornecidos por NanoSight.

Para mais informação visite por favor NanoSight.

Date Added: Oct 17, 2010 | Updated: Mar 7, 2013

Last Update: 7. March 2013 11:33

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