Dica Abordagens funcionalização para medições de Reconhecimento Molecular

Por Editores AZoNano

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Princípios-chave de Medidas Reconhecimento Molecular

Medições de reconhecimento molecular utilizando AFM são baseados na interação entre duas moléculas. Uma molécula está anexado à ponta do AFM enquanto que a molécula segundo está ligado à superfície da amostra (veja os grupos A e B da Figura 1). Funcionalização dica é os passos químicos diversos que levam a fixar as moléculas de A para a ponta do AFM.

Figura 1: A ponta do AFM é estendida na direção e, em seguida, recolhido da superfície como a deflexão do cantilever é monitorizada como uma função da distância. A parte da curva de retração (em vermelho) irá mostrar toda a força de adesão entre a ponta ea amostra. Nas medições de reconhecimento molecular força, moléculas ligantes (A) estão ligados à ponta do AFM, enquanto que moléculas receptoras (B) estão presentes na superfície da amostra. Uso de uma molécula de linker (por exemplo, PEG) resulta em um pico de curva característica de desligamento como os trechos linker, permitindo fácil identificação de interações específicas unbinding entre A e B (ver curva representativa no inset).

Na figura 1 metade direita é uma curva força-distância. A dica é primeiro trouxe perto da superfície, até que faz contato, exercendo assim uma carga positiva na superfície. A dica é retraída para trás e, durante essa ação, um pico de queda é provável que aconteça na curva de retração. Isto indica que a adesão tenha ocorrido entre a amostra ea ponta. A adesão ponta-amostra pode ser calculada se a sensibilidade de deflexão e constante de mola do cantilever são conhecidos.

Adesão entre a ponta ea amostra é geralmente observado durante a utilização não-funcionalizado dicas. Diferenciação entre a interação desejada específicas e não específicas interações é muitas vezes um desafio quando uma ponta funcionalizados é usada para medições de reconhecimento molecular. Para superar este desafio, as moléculas de intermediário chamado linkers ou espaços são usados ​​entre a molécula A e a ponta do AFM. A flexibilidade do linker oferece mobilidade para a molécula de ligante para acessar a ligação ao receptor.

Fatores a serem considerados durante funcionalização Dica

Embora várias técnicas têm sido utilizadas para anexar moléculas para sondas AFM, uma série de questões devem ser levadas em consideração:

• A seleção de uma sonda de AFM adequado é fundamental, sendo os principais fatores nitidez da ponta e mola do cantilever é constante.
• A seleção de química funcionalização dica é importante, pois a molécula de ligante deve ser conectado à ponta, para que a força de ligação entre a ponta ea molécula é mais do que a interação entre o receptor de superfície ea molécula de ligante.
• Técnicas para diminuir a densidade do ligante da superfície são cruciais para a medição única eventos de ligação.
• Fatores como temperatura, composição buffer, e pH devem ser apropriados durante a medição e funcionalização dica para que a atividade de ligação das moléculas de ligação não é alterada.

Etapas envolvidas na funcionalização Dica

Funcionalização ponta sempre começa com uma ponta de nitreto de silício ou silício em uma sonda de AFM. Duas abordagens comuns, nomeadamente através de uma aminação tiol baseado em monocamada auto-montados (SAM) e ponta aminação direta por esterificação ou silanização são usados ​​para selecionar um ponto de partida para funcionalização ponta.

Através de aminação Esterificação e Silanização

A esterificação e processos silanização funcionalizar a sonda diretamente. A reação silanização ocorre entre um grupo triclorosilano no reagente silano e um grupo triclorosilano no reagente silano. Isto leva ao desenvolvimento de uma camada de organossilano, formando Si-O-Si ligações covalentes entre as pontes de hidrogênio e as moléculas de silano ea ponta (ver Figura 2A). Aminação pode ser realizado através de esterificação pela reação de etanolamina e grupos de silanol da superfície.

Figura 2: A primeira etapa de funcionalização dica é geralmente para introduzir grupos amina (mostrado aqui como "X") para a superfície da ponta. Três métodos são amplamente utilizados: A) tratamento com silanos; B) esterificação com etanolamina, e C) formação de um SAM usando tiol-gold química.

Através de animação Self-Assembled monocamada

Um SAM é gerada através da adsorção de moléculas alkanethiol para uma ponta de ouro revestidas como mostrado na figura 2C. Revestidas de ouro sondas podem ser reciclados por erradicar todas as moléculas em anexo. Grupos tiol também têm uma grande afinidade com ouro e garantir a formação de uma interacção mais forte ponta-ligante do que a interação ligante-receptor. Cadeias acil SAM é gerar uma estrutura close-embalados que aumenta a robustez da funcionalização ponta. No entanto, esta técnica precisa ponta lado revestido de ouro sondas AFM, que têm grandes raios e não estão universalmente disponíveis.

Introdução de Molecule Linker

A próxima etapa é a introdução das moléculas vinculador. Nesta fase também oferece um controle sistemático da densidade das moléculas ligantes 'superfície. Isto pode ser alcançado através da utilização de SAM mista que contém dois tipos de moléculas com grupos terminais diversos. Esta técnica é utilizada para estudar a interação entre ciclodextrina e moléculas ferroceno, utilizando um SAM mista. Nesta fase, se o ouro-tiol abordagem SAM é selecionado, em seguida, os reagentes adequados, como PEG (polietileno glicol) / NTA (ácido N-nitrilotriacético) pode ser usado para incorporar moléculas linker e forma SAM. Na Figura 3, a maioria dos SAM consiste de trietileno-glicol-alquil-tiol enquanto o restante é composto por NTA-trietileno-glicol-alquil-tiol. A NTA tetradentados é susceptível de gerar um complexo hexagonal com cátions metálicos. Quatro ligações são formadas quelação com Ni ^{2 +} e os dois títulos são usados ​​para direcionar os grupos histidina. Assim, uma baixa percentagem de NTA-PEG-tiol laços com o ligante. O PEG-tiol permanece inerte e limita a densidade de proteínas na superfície da ponta.

Figura 3: SAMs mistos são formados em uma ponta revestidas de ouro. Apenas uma porcentagem muito baixa dos chamados NTA terminada alkanethiols estabelecerá um quelação com cátions, que também irá interagir com os grupos polyhistidine pertencentes a peptídeos ou proteínas.

Em outra técnica, onde o nitreto de silício ou a ponta de silício é amino-funcionalizados com ethanoloamine ou silanos, uma estratégia diferente é usado. Nesta técnica, o fim da molécula de PEG linker é um reage com os grupos amino de superfície. Isso permite que a outra extremidade para ligar com a proteína. Empresas utilizam uma variedade de linkers PEG heterobifunctional.

PEG linkers comumente utilizados são mostrados como Figura 4 e na Tabela 1.

Figura 4: As reações típicas entre quimicamente modificados AFM dicas e alguns aminoácidos (Asp = Aspartato, Glu = glutamato, Ser = Serina, Thr = Treonina, Cisteína Cys e Lys = = Lisina).

Tabela 1. Common objectivos vinculativos e correspondência de grupos reativos

A fase final da funcionalização dica é a reação do grupo terminal com aminoácidos na proteína da molécula ligante. Nesta fase, pontos conhecidos não devem ser alvo dentro do site funcional o ligante é vinculativo para evitar alterações na funcionalidade.

Conclusões

Esta nota tem analisado as principais aplicações e estratégias de funcionalização ponta. Os métodos descritos acima são usados ​​para forçar o volume de mapeamento de reconhecimento molecular e medidas de força de um único ponto. Conjunto inicial de resultados indicam que a funcionalização dica vai ser útil quando usado com o modo de PeakForce imagem QNM , permitindo maior resolução, mais rápido e um mapeamento de interação mais quantitativa molecular.

Bruker

Bruker Nano fornece Microscópio de Força Atômica / Microscópio Sonda (AFM / SPM) produtos que se destacam de outros sistemas disponíveis no mercado pelo seu design robusto e facilidade de uso, mantendo a mais alta resolução. A medição nanos cabeça, que faz parte de todos os nossos instrumentos, utiliza um interferômetro de fibra óptica exclusiva para medir a deflexão do cantilever, o que torna a configuração tão compacto que não é maior do que um objetivo padrão de pesquisa microscópio.

Esta informação tem sido obtida, revistos e adaptados a partir de materiais fornecidos pela Bruker AXS.

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