AFM-IR: Proyección De Imagen Subcelular Infrarroja con un Microscopio Atómico de la Fuerza

Por el Dr. Alejandro Dazzi

El Dr. Alejandro Dazzi, París-Sud de Université, Laboratoire de Chimie Physique, Batiment 201-P2, 91405 Orsay, Francia. Autor Correspondiente: alexandre.dazzi@u-psud.fr

Las herramientas existentes disponibles realizar la espectroscopia y la microscopia infrarrojas en la escala del nanómetro son limitadas considerando todos los microscopios diferentes del campo cercano. Sin Embargo AFM-IR, un nuevo spectromicroscope infrarrojo que acopla un Microscopio Atómico de la Fuerza (AFM) a un láser sintonizable, permite que los investigadores deriven la información química sobre una escala no previamente posible. La asignación de bandas de la amortiguación es no-ambigua permitiendo que los spectroscopists utilicen espectros de AFM-IR tan fácilmente como ésos obtenidos usando métodos infrarrojos clásicos.

El principio de AFM-IR1 es acoplar el AFM en modo de contacto con un láser sintonizable pulsado (Cuadro 1). Una muestra se coloca en un prisma infrarrojo-transparente y después se irradia con el laser. Cuando la longitud de onda del laser se sintoniza en las bandas de amortiguación de la muestra, la luz laser absorbente causa una subida fototérmica de la temperatura en las regiones absorbentes de la muestra. Como los aumentos de la temperatura debido a la amortiguación del IR, la muestra se despliegan. La extensión térmica local se vigila con la punta del AFM. La extensión térmica rápida de la muestra genera un impulso de la fuerza que impulse el voladizo en la oscilación. Tan cada vez que la pulsación de luz se absorbe y calienta la muestra, el voladizo oscila en su frecuencia de la resonancia. La amplitud es directamente proporcional a la energía absorbente2, así llevando a los espectros de amortiguación que se correlacionan fácilmente para abultar las técnicas de la espectroscopia del IR como FTIR. Comparado a FTIR, la sensibilidad de la técnica de AFM-IR puede químicamente determinar muestras en la escala de la talla de diez del nanómetro.

Cuadro 1: Diagrama Esquemático de la técnica de AFMIR

La técnica de AFM-IR se ha utilizado en nuestro centro de investigación (Laboratoire de Chimie Physique, Orsay, Francia) por cinco años. Los experimentos fueron fijados y corrida en el Laser Infrarouge del Centro d'Orsay (CLIO, http://clio.lcp.u-psud.fr/clio_eng/clio_eng.htm) y ahora proporciona a un beamline permanente. CLIO se ejecuta de una manera bastante inusual: Permite que ofrezcamos nuestros sistemas a los utilizadores exteriores de otros grupos de investigación. El pliego de condiciones de la fuente es ser un laser de electrón libre armonioso a partir del 3 al µm 150. El Acceso es manejado por un comité de programa similar a ésos en los centros del sincrotrón. Es en este contexto que hemos podido colaborar en varios proyectos en diversas áreas, determinado en biología3,4,5,6,7, y en nanophotonics.8,9,10

Ejemplo de Aplicación en microbiología: Ubicación de PHB en el capsulatus de Rhodobacter6

El capsulatus de Rhodobacter es una bacteria fotosintética nonsulfur púrpura, que produce un polímero, el polyhydroxybutyrate (PHB), para su almacenamiento de energía bajo dimensión de una variable de la partícula extraña de la vesícula. PHB pertenece a una clase de poliésteres y se ha utilizado por varios años en la producción de plásticos que tienen propiedades mecánicas y termoplásticas similares a ésos del polietileno y del polipropileno pero con la ventaja de poder utilizar recursos renovables. La presencia de PHB se puede sondar en el dominio mediados de-infrarrojo por la presencia de bandas de amortiguación específicas, particularmente hacia 1740 cm-1 (C=Os del éster), fácilmente distinguible de otras bandas de las bacterias: Amida I en 1660 cm-1, Amida II en 1550 cm-1.

Las imágenes superiores en el Cuadro 2 visualizan la topografía de las bacterias obtenidas por el AFM clásico. Las imágenes inferiores muestran la cartografía química correspondiente de PHB (en 1740 cm-1). En todas las correspondencias, hemos localizado alrededor de áreas donde está más intensa la señal (los dominios rojos). Estos dominios corresponden a los gránulos de PHB dentro de las bacterias (Figura 2.a, e, f). En cada correspondencia química, podemos estimar la talla de gránulos estimando el ancho en la media altura. Figure que el 2.o revela un gránulo redondo grande del diámetro y de la dimensión de una variable larga uno de 210 nanómetro de solamente 50 nanómetro grandes (parte superior de la imagen). Esta dimensión de una variable larga es muy probable el resultado de las pequeñas vesículas esféricas de PHB alineadas cerca de la membrana. La Figura 2e muestra una bacteria sin la vesícula de PHB. Esto sugiere que bajo estas condiciones de crecimiento, todas las bacterias del capsulatus de Rhodobacter no produzcan necesariamente PHB. La Figura 2f (zoom de la Figura 2e) revela que el área absorbente de hecho es compuesta por dos vesículas adyacentes de diversas tallas.

Figura 2a: Topografía del AFM de un único capsulatus de Rhodobacter.

Figura 2b: Topografía del AFM de dos bacterias separadas Rhodobacter.

Figura 2c: Zoom del AFM en la bacteria más inferior localizada en b).

Figure el 2.o: correspondencia química de PHB (en 1740 cm-1) del topogaphy correspondiente a).

Figura 2e: correspondencia química de PHB de b).

Figura 2f: correspondencia química de PHB de c).

Hemos estudiado la reacción de la espectroscopia de la vesícula (Figura 2f) y le hemos comparado con el espectro de FTIR de la cultura de las bacterias (Cuadro 3). El espectro en una única bacteria (en la Figura roja 3a) fue medido colocando la punta del AFM directamente en el máximo de la señal usando la correspondencia química de PHB (según lo apuntado por la Figura 3b). Observamos una banda intensa de C=O del éster (centrado en 1740 cm-1) mientras que la banda de la Amida I en 1660 cm-1 aparece más débil y ruidosa, demostrando la naturaleza de PHB de la mancha caliente correlacionando de la Figura 3b. El segundo espectro fue registrado colocando la punta en la punta B (Cuadro 3) en la banda de la vesícula de la amortiguación. El espectro muestra una mejor señal para la Amida I que es similar al espectro de FTIR de la cultura de las bacterias (Cuadro 3 en verde). La intensidad del PHB en ese caso ha disminuido comparado a la posición anterior, que es constante con la correspondencia química de PHB. Cuando la punta se coloca a C (el Cuadro 3), fuera de la vesícula, el espectro de AFM-IR no muestra la banda de C=O (en el Cuadro violeta 3).

Figura 3a: Comparación entre (A en rojo, B en naranja, C en violeta) los espectros locales de AFM-IR y el espectro de FTIR (en verde) de la cultura de las bacterias.

Figura 3b: correspondencia química de la bacteria de C=O de la banda del éster con la posición correspondiente (A, B, C) de las mediciones de los espectros.

Estos resultados están del interés extremo pues AFM-IR es una técnica no invasor que se puede aplicar directamente al estudio de células. Los Gracias a esta técnica, nano-resolución son alcanzables ahora para la proyección de imagen usando la radiación del IR. Esto hace proyección de imagen del IR posible en la escala subcelular, un descubrimiento en la IR-correspondencia. Spectromicroscopy representa una herramienta potente para determinar la composición ultra-local en cellulo

Release/versión en 2010, AFM-IR está disponible ahora como instrumento comercial del benchtop: el nanoIR, desarrollado y vendido por Anasys Instruments Inc.


Referencias

[1] A. Dazzi, R. Prazeres, F. Glotin, J.M. Ortega, Opta. Lett. 30, 2388 (2005).

[2] A. Dazzi, F. Glotin, y R. Carminati, J. Appl. Phys. 107, 124519 (2010)

[3] A.Dazzi, R.Prazeres, F.Glotin, J.M.Ortega, la Física Infrarroja y Tecnología, 49, 113 (2006).

[4] A.Dazzi, R.Prazeres, F.Glotin, J.M.Ortega, M.Alsawaftah, M.De Frutos, Ultramicroscopía 108, 635-641, (2008).

[5] C. Mayet, A. Dazzi, R. Prazeres, F. Allot, F. Glotin, J.M. Ortega, Opta. Lett. 33,1611-1613 (2008).

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[7] C. Policar, J.B. Waern, M.A. Plamont, S. Clède, C. Mayet, R. Prazeres, J. - M. Ortega, A. Vessières, y A. Dazzi, Edición Internacional de Angewandte Chemie, Vol. 50, Edición 4, 860-864, (2011).

[8] J.Houel, S.Sauvage, P.Boucaud, A.Dazzi, R.Prazeres, F.Glotin, J.M.Ortéga, A.Miard, A.Lemaître, Rev Lett 99, 217404 de Phys (2007).

[9] J. Houel, E. Homeyer, S. Sauvage, P. Boucaud, A. Dazzi, R. Prazeres, J.M.Ortega, la Óptica Exp., 17, 10887-10894 (2009).

[10] S. Sauvage, A. Driss, F. Réveret, P. Boucaud, A. Dazzi, R. Prazeres, F. Glotin, J. - M. Ortéga, A. Miard, Y. Halioua, F. Raineri, I. Sagnes y A. Lemaître, Phys. Rev. B 83, 035302 (2011).

Date Added: Jul 17, 2011 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 14. June 2013 09:51

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