AFM-IR: Rappresentazione Sottocellulare Infrarossa con un Microscopio Atomico della Forza

Da Dott. Alexandre Dazzi

Dott. Alexandre Dazzi, Parigi-Sud di Université, Laboratoire de Chimie Physique, Batiment 201-P2, 91405 Orsay, Francia. Autore Corrispondente: alexandre.dazzi@u-psud.fr

Gli strumenti attuali disponibili eseguire la spettroscopia e la microscopia infrarosse al disgaggio di nanometro sono limitati considerando tutti i microscopi differenti del quasi-campo. Tuttavia AFM-IR, un nuovo spectromicroscope infrarosso che accoppia un Microscopio Atomico della Forza (AFM) ad un laser musicale, permette che i ricercatori derivino le informazioni chimiche su un disgaggio non precedentemente possibile. L'assegnazione delle bande di assorbimento è non ambigua permettendo che gli spectroscopists usino facilmente gli spettri di AFM-IR quanto quelli ottenuti facendo uso dei metodi infrarossi classici.

Il principio di AFM-IR1 è di coppia il AFM nel modo di contatto con un laser (Figura musicale pulsato 1). Un campione è collocato su un prisma infrarosso-trasparente e poi è irradiato con il laser. Quando la lunghezza d'onda del laser è sintonizzata sulle bande di assorbimento del campione, la luce laser assorbente causa un aumento di temperatura photothermal nelle regioni assorbenti del campione. Come gli aumenti della temperatura dovuto assorbimento di IR, il campione si espande. L'espansione termica locale è riflessa con il suggerimento del AFM. L'espansione termica rapida del campione genera un impulso della forza che guida la trave a mensola in oscillazione. Così ogni volta l'impulso luminoso è assorbito e riscalda il campione, la trave a mensola oscilla alla sua frequenza di risonanza. L'ampiezza è direttamente proporzionale all'energia assorbente2, così piombo agli spettri di assorbimento che sono correlati prontamente per ammassare tecniche della spettroscopia di IR come FTIR. Confrontato a FTIR, la sensibilità della tecnica di AFM-IR può chimicamente identificare i campioni sul disgaggio di dimensione dei dieci del nanometro.

Figura 1: Disegno Schematico della tecnica di AFMIR

La tecnica di AFM-IR è stata utilizzata nel nostro centro di ricerca (Laboratoire de Chimie Physique, Orsay, Francia) per cinque anni. Gli esperimenti sono stati installati ed esecuzione al Laser Infrarouge del Centro d'Orsay (CLIO, http://clio.lcp.u-psud.fr/clio_eng/clio_eng.htm) ed ora fornisce un beamline permanente. CLIO è fatto funzionare in un modo piuttosto insolito: Permette che noi offriamo i nostri sistemi agli utenti esterni da altri gruppi di ricerca. La specifica della sorgente è di essere un laser a elettroni liberi musicale da 3 a µm 150. Access è gestito da un comitato per l'elaborazione dei programmi simile a quelli ai centri del sincrotrone. È in questo contesto che abbiamo potuti collaborare su parecchi progetti nelle aree differenti, specialmente nella biologia3,4,5,6,7e in nanophotonics.8,9,10

Esempio di Applicazione in microbiologia: Posizione di PHB nel capsulatus di Rhodobacter6

Il capsulatus di Rhodobacter è un batterio fotosintetico nonsulfur porpora, che produce un polimero, polyhydroxybutyrate (PHB), per il suo immagazzinamento dell'energia nell'ambito di forma dell'inclusione della vescicola. PHB appartiene a classe A di poliesteri ed è stato utilizzato per parecchi anni nella produzione della plastica che ha simili beni meccanici e termoplastici a quelle di polietilene e di polipropilene ma con il vantaggio di potere usare le risorse rinnovabili. La presenza di PHB può essere sondata nel dominio di mezzo infrarosso dalla presenza di bande di assorbimento specifiche, in particolare verso il 1740 il cm-1 (C=Os di estere), facilmente distinguibile da altre bande dei batteri: Ammide I a 1660 cm-1, Ammide II a 1550 cm-1.

Le immagini superiori nella Figura 2 video la topografia dei batteri ottenuti dal AFM classico. Le immagini inferiori mostrano la cartografia chimica corrispondente di PHB (a 1740 cm-1). Su tutte le mappe, abbiamo localizzato intorno alle aree dove il segnale è più intenso (domini rossi). Questi domini corrispondono ai granuli di PHB dentro i batteri (Figura 2 d, e, f). Su ogni mappa chimica, possiamo stimare la dimensione dei granuli stimando la larghezza alla mezza altezza. Calcoli che il 2d rivela un grande granulo rotondo del diametro di 210 nanometro e della forma lunga uno di soltanto 50 nanometro grandi (cima dell'immagine). Questa forma lunga è molto probabile il risultato di piccole vescicole sferiche di PHB allineate vicino alla membrana. La Figura 2e mostra un batterio senza vescicola di PHB. Ciò suggerisce che in queste circostanze di crescita, tutti i batteri di capsulatus di Rhodobacter necessariamente non producano PHB. La Figura 2f (zoom della Figura 2e) rivela che l'area assorbente in effetti è composta da due vescicole adiacenti delle dimensioni differenti.

Figura 2a: Una topografia del AFM di un singolo capsulatus di Rhodobacter.

Figura 2b: Una topografia del AFM di due batteri separati Rhodobacter.

Figura 2c: Zoom del AFM sul batterio più basso localizzato su b).

Calcoli il 2d: mappatura chimica di PHB (a 1740 cm-1) del topogaphy corrispondente a).

Figura 2e: mappatura chimica di PHB di b).

Figura 2f: mappatura chimica di PHB di c).

Abbiamo studiato la risposta della spettroscopia della vescicola (Figura 2f) e gli abbiamo paragonato allo spettro di FTIR della cultura dei batteri (Figura 3). Lo spettro su un singolo batterio (nella la Figura rossa 3a) è stato misurato posizionando il suggerimento del AFM direttamente sul massimo del segnale facendo uso della mappatura chimica di PHB (come indicato dalla Figura 3b). Osserviamo una banda intensa di C=O di estere (concentrato a 1740 cm-1) mentre la banda dell'Ammide I a 1660 cm-1 sembra più debole e rumorosa, dimostrante la natura di PHB dell'area sensibile mappanti dalla Figura 3b. Il secondo spettro è stato registrato posizionando il suggerimento a punto la B (Figura 3) al confine della vescicola di assorbimento. Lo spettro mostra un migliore segnale per l'Ammide I che è simile allo spettro di FTIR della cultura dei batteri (Figura 3 nel verde). L'intensità del PHB in quel caso è diminuito confrontato alla posizione precedente, che è coerente con la mappatura chimica di PHB. Quando il suggerimento è posizionato sulla C (Figura 3), dalla vescicola, lo spettro di AFM-IR non mostra la banda di C=O (nella Figura viola 3).

Figura 3a: Confronto fra (A nel rosso, B in arancia, C nella viola) gli spettri locali di AFM-IR e lo spettro di FTIR (nel verde) della cultura dei batteri.

Figura 3b: mappatura chimica del batterio di C=O della banda dell'estere con la posizione corrispondente (A, B, C) delle misure di spettri.

Questi risultati sono di massimo interesse poichè AFM-IR è una tecnica non invadente che può applicarsi direttamente allo studio degli unicellulari. Grazie a questa tecnica, nano-risoluzione ora è raggiungibili per la rappresentazione facendo uso di radiazione di IR. Ciò permette la rappresentazione di IR al disgaggio sottocellulare, un'innovazione nella IR-mappatura. Spectromicroscopy rappresenta uno strumento potente per determinare la composizione nel ultra-locale in cellulo

Rilasciato nel 2010, AFM-IR ora è disponibile come strumento commerciale del benchtop: il nanoIR, sviluppato e venduto da Anasys Instruments Inc.


Riferimenti

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[10] S. Sauvage, A. Driss, F. Réveret, P. Boucaud, A. Dazzi, R. Prazeres, F. Glotin, J. - M. Ortéga, A. Miard, Y. Halioua, F. Raineri, I. Sagnes ed A. Lemaître, Phys. Rev. B 83, 035302 (2011).

Date Added: Jul 17, 2011 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 14. June 2013 06:59

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