AFM-IR: Imagem Lactente Secundário-Celular Infravermelha com um Microscópio Atômico da Força

Pelo Dr. Alexandre Dazzi

Dr. Alexandre Dazzi, Paris-Sul de Université, Laboratoire de Chimie Físico, Batiment 201-P2, 91405 Orsay, França. Autor Correspondente: alexandre.dazzi@u-psud.fr

As ferramentas existentes disponíveis para executar a espectroscopia e a microscopia infravermelhas na escala do nanômetro são limitadas considerando todos os microscópios diferentes do próximo-campo. Contudo AFM-IR, um spectromicroscope infravermelho novo que acopla um Microscópio Atômico da Força (AFM) a um laser ajustável, permite que os pesquisadores derivem a informação química em uma escala não previamente possível. O encargo das faixas da absorção é não-ambíguo permitindo que os spectroscopists usem espectros de AFM-IR tão facilmente quanto aqueles obtidos usando métodos infravermelhos clássicos.

O princípio de AFM-IR1 é acoplar o AFM no modo de contacto com um laser ajustável pulsado (Figura 1). Uma amostra é colocada em um prisma infravermelho-transparente e irradiada então com o laser. Quando o comprimento de onda do laser é ajustado nas faixas de absorção da amostra, o laser absorvido causa uma elevação fototérmica da temperatura nas regiões absorventes da amostra. Como os aumentos da temperatura devido à absorção do IR, a amostra expandem. A expansão térmica local é monitorada com a ponta do AFM. A expansão térmica rápida da amostra gera um impulso da força que conduza o modilhão na oscilação. Assim cada vez que a pulsação de luz é absorvida e aquece a amostra, o modilhão oscila em sua freqüência da ressonância. A amplitude é directamente proporcional à energia absorvida2, assim conduzindo aos espectros de absorção que são correlacionados prontamente para aumentar técnicas da espectroscopia do IR como FTIR. Comparado a FTIR, a sensibilidade da técnica de AFM-IR pode identificar quimicamente amostras na escala do tamanho dos dez do nanômetro.

Figura 1: Diagrama Esquemático da técnica de AFMIR

A técnica de AFM-IR foi usada em nosso centro de pesquisa (Laboratoire de Chimie Físico, Orsay, França) por cinco anos. As experiências estabeleceram-se e corrida no Laser Infrarouge do Centro d'Orsay (CLIO, http://clio.lcp.u-psud.fr/clio_eng/clio_eng.htm) e fornece agora um beamline permanente. CLIO é executado em uma maneira um pouco incomum: Permite que nós ofereçam nossos sistemas aos usuários exteriores de outros grupos de investigação. A especificação da fonte é ser um laser de elétron livre ajustável de 3 ao µm 150. O Acesso é controlado por um comitê de programa similar àqueles em centros do synchrotron. É neste contexto que nós pudemos colaborar em diversos projectos em áreas diferentes, particularmente na biologia3,4,5,6,7, e no nanophotonics.8,9,10

Exemplo de Aplicação na microbiologia: Lugar de PHB no capsulatus de Rhodobacter6

O capsulatus de Rhodobacter é uma bactéria fotossintética nonsulfur roxa, que produza um polímero, o polyhydroxybutyrate (PHB), para seu armazenamento de energia sob a forma da inclusão da vesícula. PHB pertence a uma classe de poliésteres e foi usado por diversos anos na produção de plásticos que têm propriedades mecânicas e termoplásticos similares àqueles do polietileno e do polipropileno mas com a vantagem de poder usar recursos renováveis. A presença de PHB pode ser sondada no domínio meados de-infravermelho pela presença de faixas de absorção específicas, em particular por volta de 1740 cm-1 (C=Os do éster), facilmente distinguível de outras faixas das bactérias: Amido Mim em 1660 cm-1, Amido II em 1550 cm-1.

As imagens superiores em Figura 2 indicam a topografia das bactérias obtidas pelo AFM clássico. As imagens inferiores mostram a cartografia química correspondente de PHB (em 1740 cm-1). Em todos os mapas, nós localizamos em volta das áreas onde o sinal é mais intenso (domínios vermelhos). Estes domínios correspondem aos grânulo de PHB dentro das bactérias (Figura 2 d, e, f). Em cada mapa químico, nós podemos calcular o tamanho dos grânulo calculando a largura na meia altura. Figure que o 2d revela um grânulo redondo grande do diâmetro de 210 nanômetro e da forma longa um de somente 50 nanômetro grandes (parte superior da imagem). Esta forma longa é muito provável o resultado das vesículas esféricas pequenas de PHB alinhadas perto da membrana. A Figura 2e mostra uma bactéria sem vesícula de PHB. Isto sugere que sob estas circunstâncias de crescimento, todas as bactérias do capsulatus de Rhodobacter não produzam necessariamente PHB. A Figura 2f (zoom da Figura 2e) revela que a área absorvente de facto está compor por duas vesículas adjacentes de tamanhos diferentes.

Figura 2a: Topografia do AFM de um único capsulatus de Rhodobacter.

Figura 2b: Topografia do AFM de duas bactérias separadas Rhodobacter.

Figura 2c: Zoom do AFM na mais baixa bactéria localizada em b).

Figure o 2d: traço químico de PHB (em 1740 cm-1) do topogaphy correspondente a).

Figura 2e: traço químico de PHB de b).

Figura 2f: traço químico de PHB de c).

Nós estudamos a resposta da espectroscopia da vesícula (Figura 2f) e comparamos-lhe com o espectro de FTIR da cultura das bactérias (Figura 3). O espectro em uma única bactéria (na Figura vermelha 3a) foi medido posicionando a ponta do AFM directamente sobre o máximo do sinal usando o traço químico de PHB (como aguçado pela Figura 3b). Nós observamos uma faixa intensa de C=O do éster (centrado em 1740 cm-1) visto que o Amido Eu faixa em 1660 cm-1 pareço mais fraco e ruidoso, demonstrando a natureza de PHB do hot spot traçando da Figura 3b. O segundo espectro foi gravado posicionando a ponta no ponto B (Figura 3) na beira da vesícula da absorção. O espectro mostra-me a um sinal melhor para o Amido que é similar ao espectro de FTIR da cultura das bactérias (Figura 3 no verde). A intensidade do PHB nesse caso diminuiu comparado à posição precedente, que é consistente com o traço químico de PHB. Quando a ponta está posicionada a C (Figura 3), fora da vesícula, o espectro de AFM-IR não mostra a faixa de C=O (em Figura violeta 3).

Figura 3a: Comparação entre (A no vermelho, B na laranja, C na violeta) espectros locais de AFM-IR e espectro de FTIR (no verde) da cultura das bactérias.

Figura 3b: traço químico da bactéria de C=O da faixa do éster com posição correspondente (A, B, C) das medidas dos espectros.

Estes resultados são do interesse máximo porque AFM-IR é uma técnica não invasora que possa ser aplicada directamente ao estudo de únicas pilhas. Os Agradecimentos a esta técnica, nano-definição são agora atingíveis para a imagem lactente usando a radiação do IR. Isto torna a imagem lactente do IR possível na escala subcelular, uma descoberta no IR-traço. Spectromicroscopy representa uma ferramenta poderosa para determinar a composição ultra-local no cellulo

Liberado em 2010, AFM-IR está agora disponível como um instrumento comercial do benchtop: o nanoIR, desenvolvido e vendido por Anasys Instrumentos Inc.


Referências

[1] A. Dazzi, R. Prazeres, F. Glotin, J.M. Ortega, Opta. Lett. 30, 2388 (2005).

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[4] A.Dazzi, R.Prazeres, F.Glotin, J.M.Ortega, M.Alsawaftah, M.De Frutos, Ultramicroscopy 108, 635-641, (2008).

[5] C. Mayet, A. Dazzi, R. Prazeres, F. Atribuição, F. Glotin, J.M. Ortega, Opta. Lett. 33,1611-1613 (2008).

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[7] C. Policar, J.B. Waern, M.A. Plamont, S. Clède, C. Mayet, R. Prazeres, J. - M. Ortega, A. Vessières, e A. Dazzi, Edição Internacional de Angewandte Chemie, Vol 50, Edição 4, 860-864, (2011).

[8] J.Houel, S.Sauvage, P.Boucaud, A.Dazzi, R.Prazeres, F.Glotin, J.M.Ortéga, A.Miard, A.Lemaître, Rev Lett 99 de Phys, 217404 (2007).

[9] J. Houel, E. Homeyer, S. Sauvage, P. Boucaud, A. Dazzi, R. Prazeres, J.M.Ortega, Sistema Ótico Exp., 17, 10887-10894 (2009).

[10] S. Sauvage, A. Driss, F. Réveret, P. Boucaud, A. Dazzi, R. Prazeres, F. Glotin, J. - M. Ortéga, A. Miard, Y. Halioua, F. Raineri, I. Sagnes e A. Lemaître, Phys. Rev. B 83, 035302 (2011).

Date Added: Jul 17, 2011 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 14. June 2013 09:44

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