Fluoreszenz-Geführte Kraft-Spektroskopie u. Anerkennungs-Darstellung auf Zellen über ILM/AFM

Themen Umfaßt

Einleitung
    Fluoreszenz Mikroskopie in der Lebende ZellAnalyse
    Kombination von FLUGHANDBUCH-Methoden mit Fluoreszenz-Anerkennungs-Darstellung
Überblick über Experimente
Verankertes Grünes LeuchtstoffProtein Glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GFP)
Moleküle CD4 Fixiert mit Gelbem LeuchtstoffProtein (YFP)
Zusammenfassung
Bezüge
Über Agilent-Technologien

Einleitung

Fluoreszenz Mikroskopie in der Lebende ZellAnalyse

Fluoreszenzmikroskopie ist ein wichtiges Hilfsmittel für die Lokalisierung von Empfänger-/Ligandinteraktionen in lebenden Zellen geworden. Die Kennzeichnung verschiedenen von Proteinen mit verschiedenen Spektral-fluorophores erlaubt Darstellung von verschiedenen zellulären, subzellularen oder molekularen Bauteilen und von Bestimmung der spezifischen Lokolisierung der Proteine in den Zellen. Die Rückweisung des unerwünschten, kurzwelligen Hintergrundes (Rayleigh Zerstreuen der Erregungsleuchte) durch die Spektralentstörung verbessert den Kontrast von speziell beschrifteten Zellaufbauten in der Fluoreszenzmikroskopie. Die seitlichen und axialen Auflösungen werden durch die Beugungsgrenze auf Leuchte und Ergebnis in ~200nm-Auflösung begrenzt. Vor Kurzem sind Techniken mit höherer Auflösung, wie Entleerung der angeregten Emission (STED) entwickelt worden, Lokolisierungsmikroskopie (PALM) und stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STURM) Foto-aktivierten, die seitliche Auflösung von 10-30nm erzielen.

Kombination von FLUGHANDBUCH-Methoden mit Fluoreszenz-Anerkennungs-Darstellung

Optische Techniken können keine Informationen der Beispieltopographie jedoch zur Verfügung stellen. Durch Kontrast erlaubt Atomkraft (AFM)mikroskopie, dass topographische Bilder an der nmschuppe in den flüssigen Umgebungen und bei Zimmertemperatur erhalten werden. Darüber hinaus kann die Anerkennung des Empfängers/der Ligandpaare auf dem Einzelmolekül Niveau nachgeforscht werden.

Eine neuentwickelte simultane Topographie und eine Anerkennungsabbildungstechnik, durchgeführt, PicoTREC von Agilent-Technologien für die Arbeit verwendend, die hierin einzeln aufgeführt wird, ist zum Erbringen eines topographischen Bildes sowie der Karte von Anerkennungssites des gleichen Bereiches mit einem einzelnen Scan an der Auflösung des Seitenteils 5nm fähig. Das neuen Funktionsprinzip der Technik ist das selbe wie für dynamische Modus FLUGHANDBUCH-Darstellung. Ein Kragbalken wird nahe seiner Resonanzfrequenz oszilliert und gescannt über der Beispieloberfläche, aber in diesem Fall wird der Kragbalken chemisch empfindlich hergestellt, indem man einen Ligand über ein kurzes Verknüpfungsprogramm zu seinem Umkippung befestigt. Die Bindungsstellen sind von der Reduzierung der Oszillationsamplitude offensichtlich. Die Erhöhte Signalaufbereitung, im Verbindung mit einer geänderten Rückkopplungsschleife, liefert ein Anerkennungsbild, das gleichzeitig neben einem Topographiebild erworben wird.

Im Wesentlichen wird die Trennung von topographischen und Anerkennungsereignissen erzielt, indem man die Oszillationsamplitude des Kragbalkens in die untereren und oberen Teile aufspaltet (in Bezug auf die Ruhestellung des Kragbalkens). Die Maxima dieser Teile werden dann verwendet, um die Topographie (unterere Teile) und Anerkennungsbild (obere Teile) gleichzeitig aufzuzeichnen.

Dieser Artikel behandelt die Fähigkeit des Atomkraftmikroskops Agilent 6000ILM, die FLUGHANDBUCH-Spitze zu den Regionen von Zinsen unter Verwendung eines Kontrast-erhöhten optischen Bildes und ein Fluoreszenzbild leicht in Position zu bringen und die nachfolgende TREC-Darstellungs- und -kraftspektroskopie, die hohe Wechselbeziehung unter Fluoreszenzintensität, verbindliche Wahrscheinlichkeit und Anerkennungsbereich zeigen, sowie die Sichtbarmachung der anerkannten nanodomains auf Zellen mit verschiedenen Niveaus des Proteinausdrucks.

Überblick über Experimente

Eins der faszinierendsten Themen in der Biowissenschaft und im bionanotechnology ist die Untersuchung von Zellen und von Einteilung und Funktion von Proteinen in der Zellmembran. Zellsignalisieren, Nachrichtenübermittlung zu benachbarten Zellen und Transport zum anliegenden Gewebe wird ganz durch Membranproteine organisiert. Zwei Beispiele von wichtigen Proteinanlagen für Zellsignalisieren und Zellmembraneinteilung werden hier dargestellt.

FLUGHANDBUCH-Experimente wurden unter Verwendung eines Agilent 6000ILM FLUGHANDBUCHS durchgeführt, das an einem Beobachter Zeiss Axio A1 montiert wurde (für Maß von Zellen mit GPI-GFP) oder a BIS Photonicsfluorescence-Mikroskop (für Maß von Zellen mit YFP-CD4). Alle Bilder wurden in PBS bei Zimmertemperatur unter Verwendung Agilent-MAC Modus erworben (d.h., magnetischer WS). Agilent-Baumuster VI und VII MAC Hebel wurden verwendet und FLUGHANDBUCH-Bilder wurden unter Verwendung Software Agilent PicoView erworben. Kragbalken für Kraftspektroskopie wurden im Chloroform dreimal gewaschen, getrocknet in einer Luft, gewaschen in der Piranha (30% HO und22 70% HSO)2 für4 Protokoll 30, ausgespült mit Wasser, und getrocknet, indem man an den Kragbalken 100°C. für TREC-Darstellung heizte, wurden im Chloroform dreimal gewaschen und getrocknet in einer Luft. Alle Kragbalken wurden dann mit APTES behandelt, konjugierten mit NHS-PEG- Aldehyde oder NHS-KLAMMER-Acetal und verbanden nachfolgend mit Antikörper [1].

Verankertes Grünes LeuchtstoffProtein Glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GFP)

In der Plasmamembran von Zellen, gibt es Cholesterin und die sphingolipid-angereicherten Gebiete, bezeichnet ` Lipid flößt'. Diese Lipidflösse dienen als organisierende Mitten für die Montage von Signalisierenmolekülen, beeinflussen Membranflüssigkeit und Membranprotein handelnd und beeinflussen auch das Empfängerhandeln. Zum Beispiel nach dem spezifischen Starten, versetzen Membranempfänger wie T-Zell-Rezeptoren oder B-Zellenempfänger in Lipidflösse, das die Voraussetzung für effizienten Empfänger-vermittelten Signal Transduction ist.

Das Agilent 6000ILM FLUGHANDBUCH erlaubte die Untersuchung der Morphologie und der Verteilung der Lipidflösse auf Zellen. Für dieses Zellen T24 (menschliche Blasenkrebsgeschwürzellen) - die transfected, um GPI-Anker, der von DAF, das berechnet wurde zu GFP [fixiert wurde bezeichnet GPI- (DAF) - GFP], eine in hohem Grade effektive Lipidflossmarkierung [2] auszudrücken - wurden auf Glasunterseite Petrischalen gewachsen. Vor Darstellung wurden die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 30 Min. geregelt.

Das topographische Bild (Figure1A) der Zellen wurde unter Verwendung Agilent-MAC Modus erhalten. Die Darstellungskraft war so leicht, dass die Fäden des Cytoskeleton unter die Plasmamembran kaum gesehen werden können. Lamellipodia an der Zellgrenze kann jedoch offenbar entdeckt werden. Das Niveau von GPI- (DAF) - GFP-Ausdruck in den Zellen wurde geprüft, indem man GFP-Fluoreszenzbilder erhielt (Figure1B).

Abbildung 1. (a) FLUGHANDBUCH-Topographie von den örtlich festgelegten Zellen T24, die GPI-GFP ausdrücken (Bildgröße: 50μm). Das Bild wurde mit MAC Modus in PBS gemessen, indem man ein Agilent-Baumuster DAS VI MAC Hebel verwendete, der ungefähr an 16kHz und an 7nm mit einer Darstellungsdrehzahl von 15μm/s. oszilliert. Die Darstellungskraft war so leicht, dass die Fäden des Cytoskeleton unter die Plasmamembran kaum gesehen werden können. Lamellipodia an der Zellgrenze kann jedoch offenbar entdeckt werden. (b) Fluoreszenzbild (FITC-Filterset, 100 x-Vergrößerung) der gleichen Zellen, die das Ausdruckniveau von GPI-GFP zeigen. Einige helle Regionen nah an dem Kern zeigen den Endoplasmanetzmagen (ER) an, in dem die GPI-verankerten Proteine synthetisiert werden. Über den ER-Regionen hinaus schaut die Verteilung von GPI-GFP in der Plasmamembran, außer einigen hellen Punkten homogen (z.B., die im roten Quadrat). (c) Indem es den Kragbalken verwendete, der mit dem anti--GFP Antikörper functionalized ist, deckte das Anerkennungsbild der Region, die mit dem roten Quadrat in (b) markiert wurde, nanodomains mit einer Größe von ungefähr 200-300nm auf. In der Region, die mit dem gestrichelten blauen Kreis markiert wird, sind die nanodomains angesammelt worden, der gut mit dem microdomain aufeinander bezieht, das im Fluoreszenzbild gezeigt wird. Während der Anerkennungsdarstellung oszillierte der Kragbalken bei 16 kHz und an ungefähr 7nm mit einer Darstellungsdrehzahl der Größe des Bildes 6.5μm/s.: 5μm.

Nah an dem Kern der Zellen gibt es einige Regionen mit sehr hoher Fluoreszenzintensität, die mit der Tatsache übereinstimmt, dass die GPI-verankerten Proteine im Endoplasmanetzmagen synthetisiert werden, der (ER) den Kern der Zellen umgibt (siehe Abbildung 2). Über den ER-Regionen hinaus gibt es keine Wechselbeziehung zwischen der topographischen Höhe und der Fluoreszenzintensität, die dass die meisten des GPI- (DAF) - GFP-Moleküle sind in der Plasmamembran eher als im Cytosol vorschlägt. Gelegentlich können einige helle Fluoreszenzpunkte weit weg von der ER-Region gefunden werden, wie mit dem roten Quadrat markiert worden (Figure1B). Solche hellen Punkte sind möglicherweise Bäschen im Cytosol oder microdomain in der Plasmamembran. Im Allgemeinen zeigt die herkömmliche Fluoreszenzmikroskopie mit der höchsten Vergrößerung (100x) eine homogene Verteilung von GPI- (DAF) - GFP in der Plasmamembran.

Abbildung 2. Schematisches Diagramm von der kombinierten optischen und Atomkraftmikroskopie für Anerkennungsmaße auf Zelle. GPI-verankertes GFP wird in ER synthetisiert, geändert in Golgi und transportiert über Bäschen zur Plasmamembran. Während das optische Mikroskop die Gesamtausdruck Stufen- und Mikrometerschuppenverteilung von GPI-GFP durch das Fluoreszenzmaß prüfen kann, kann die Anerkennungsdarstellung durch den Antikörper-functionalized Kragbalken die Verteilung von GPI-GFP an der nmschuppe sichtbar machen. Für Anerkennungsdarstellung oszilliert der Kragbalken an der konstanten Amplitude. Wenn der Antikörper auf der Spitze mit dem GFP auf der Zelloberfläche bindet, wird der obere Teil der Oszillationswelle verringert. Dieses kann durch den Kasten Agilent PicoTREC entdeckt werden, in dem die Oszillationswelle in die oberen und untereren Teile aufgespaltet wird. Der obere Teil der Oszillationswelle wird verwendet, um das Anerkennungsbild zu konstruieren. Hier werden Anerkennungsereignisse im Rot gezeigt.

Um die Verteilung von GPI- (DAF) - GFP nachzuforschen auf dem nmniveau, wurde TREC-Darstellung verwendet. Das Prinzip von TREC-Darstellung unter Verwendung einer freitragenden Spitze, die mit anti--GFP Antikörper functionalized ist, wird in Abbildung 2. gezeigt. Während der Darstellung oszilliert der Kragbalken (getrieben durch ein Magnetfeld) an einer konstanten Amplitude. Wenn der Antikörper auf der Spitze mit dem GFP auf der Zelloberfläche bindet, wird der obere Teil der Oszillation verringert. Dieses kann durch den Kasten Agilent PicoTREC entdeckt werden, in dem die Oszillationswelle in die oberen und untereren Teile aufgespaltet wird. Vom oberen Teil der Oszillationswelle, kann das Anerkennungsbild konstruiert werden; der Bereich mit einem verbindlichen Ereignis wird als dunkler Fleck gezeigt.

Das Anerkennungsbild der Region, die mit dem roten Quadrat in Figure1B markiert wird, wird in der Abbildung 1C gezeigt. Vom Anerkennungsbild kann es gesehen werden dass das GPI- (DAF) - GFP-Moleküle bildet nanodomains mit einer Größe von ungefähr 200-300nm. In der Region, die mit dem gestrichelten blauen Kreis markiert wird, sind die nanodomains angesammelt worden, der wie ein microdomain im Fluoreszenzbild aussieht. Solch Ein microdomain liefert eine eindeutige Brücke, um die Wechselbeziehung zwischen der Fluoreszenz und den Anerkennungsbildern zu zeigen.

Moleküle CD4 Fixiert mit Gelbem LeuchtstoffProtein (YFP)

CD4 (Cluster von Unterscheidung 4), ein Glucoproteid ursprünglich gefunden auf der Oberfläche von T-Helferzellen, Spiele eine sehr wichtige Rolle in der Immunologie und die Krankheit von HIV. Die Verteilung des Proteins CD4 wurde auf Zellen T24 nachgeforscht, die transfected, um YFP-fixiertes CD4 auszudrücken. Solche Zellen waren örtlich festgelegt und abgebildet, indem sie Fluoreszenzmikroskopie und FLUGHANDBUCH verwendeten. Vom brightfield Bild und vom Fluoreszenzbild (Abbildungen 3A und 3B), wurde es dass einige der Zellen gefunden (z.B., Zelle 1 in Abbildung 3) haben hohen Ausdruck von YFP-CD4, während einige andere Zellen (z.B., Zelle 2 in Abbildung 3) haben sehr niedrigen Ausdruck.

Abbildung 3. (a) Brightfield-Bild und (b) Fluoreszenzbild von örtlich festgelegten Zellen T24 transfected mit YFP-CD4 aufdecken dass einige der Zellen (z.B., Zelle 1) haben hohen Ausdruck von YFP-CD4, während einige andere Zellen (z.B., Zelle 2) haben sehr niedrigen Ausdruck. Mit der Lenkung der optischen Bilder, wurden Kraftspektroskopie und Anerkennungsdarstellung an Zelle 1 und an Zelle 2. durchgeführt. Auf Zelle 1, wurden 244 Kraftabstand Kurven gemessen, von denen 220 verbindliche Ereignisse der Kurvenshow, mit dem Ergebnis einer verbindlichen Wahrscheinlichkeit von 90,2%. (FI) Die FLUGHANDBUCHtopographie- und -anerkennungsbilder, die auf Zelle 1 und Zelle 2 mit einem Agilent-Baumuster DAS VII MAC Hebel gemessen wurden, functionalized mit Antikörper anti-CD4. Bilder auf den zwei Zellen wurden mit der gleichen Spitze an der gleichen Frequenz (8kHz) und an der Amplitude (über 50nm) mit einer Darstellungsdrehzahl ungefähr 1.9μm/s. der Zelle 1 gemessen (Panel H) zeigte viele großen Anerkennungsstellen mit einer Größe, die von 100 bis zu 200nm, während Zelle 2 reicht (Panel I) zeigte viel kleinere Stellen mit weiterem Abstand.

Mit der Lenkung der optischen Bilder, wurden Kraftspektroskopie und Anerkennungsdarstellung an Zellen 1 und 2. durchgeführt. Für diese Maße functionalized die freitragenden Spitzen mit Antikörper anti-CD4. Auf Zelle 1, wurden 244 Kraftabstand Kurven gemessen, von denen 220 verbindliche Ereignisse der Kurvenshow, mit dem Ergebnis einer verbindlichen Wahrscheinlichkeit von 90,2% (Abbildung 3D). Eine typische Kraftabstand Kurve mit einem verbindlichen Ereignis wird in der Abbildung 3C gezeigt. Auf Zelle 2, wurden 241 Kraftabstandskurven gemessen, von denen nur 10 verbindliche Ereignisse der Kurvenshow, mit dem Ergebnis einer verbindlichen Wahrscheinlichkeit von 4,1%. Eine typische Kraftabstand Kurve ohne ein verbindliches Ereignis wird in der Abbildung 3E gezeigt. Die Kraftabstand Kurvenmaße auf den zwei Zellen wurden mit der gleichen Spitze durchgeführt. Verbindliche Wahrscheinlichkeit für cells1 und 2 stimmt sehr gutes mit der Fluoreszenzintensität überein.

Abbildungen 3F zur Show 3I die FLUGHANDBUCHtopographie- und -anerkennungsbilder, die auf Zellen1 und 2. Bildern auf diesen zwei Zellen gemessen wurden, wurden mit der gleichen Spitze an der gleichen Frequenz und an der Amplitude gemessen. Es wurde gefunden, dass es viele großen Anerkennungsstellen auf Zelle 1 (Abbildung 3H) mit einer Größe gibt, die von 100 bis zu 200nm reicht. Die Meisten Anerkennungsstellen sind in den Lochregionen in der Topographie, aber Anerkennungsstellen können in hervorstehenden Regionen in der Topographie auch gefunden werden (Abbildung 3F).

Viele der nanodomains werden bereits mit einander angeschlossen. Solch Ein High-density von Anerkennungsstellen stimmt mit dem starken Fluoreszenzsignal auf Zelle 1 überein, und ist mit der hohen verbindlichen Wahrscheinlichkeit von der Kraftspektroskopie identisch. Andererseits sind die Anerkennungsstellen auf Zelle 2 (Abbildung 3I) normalerweise kleiner als die auf Zelle 1, und der Abstand zwischen Anerkennungsstellen ist im Allgemeinen größer als die auf Zelle 1. Der Gesamtbereich von Anerkennungsstellen auf Zelle 2 ist viel kleiner als der auf Zelle 1, die sehr gut mit der Ausdruckstufe aufeinander bezieht, die durch das Fluoreszenzbild aufgedeckt wird.

Um die Besonderheit der Anerkennungsstellen weiter zu prüfen, wurde ein Blockexperiment durchgeführt indem man freien Antikörper anti-CD4 in die Maßlösung einspritzte. Abbildung 4 zeigt, dass die Topographie der Zellmembran nach dem Block ähnlich schaute; jedoch wurden die Anerkennungsstellen beträchtlich durch den eingespritzten freien Antikörper verringert. Für Darstellung, bevor und nachdem der Block, der gleiche Kragbalken an der gleichen Schwingungszahl und an Amplitude verwendet wurde. Die klare Reduzierung der Anerkennungsstellen bestätigte die Besonderheit der Anerkennung-Darstellung-aufgedeckten nanodomains CD4.

Abbildung 4. (a) Topographie und (b) Anerkennungsbilder auf den örtlich festgelegten Zellen T24, die YFP-CD4 vor dem Block, abgebildet ist nach Agilent-Baumuster das VII Mac-Hebel ausdrücken, functionalized mit Antikörper anti-CD4. Ungefähr 2,5 Stunden nach Einspritzung von freien Molekülen des Antikörpers anti-CD4 (mit einer abschließenden Konzentration von 0.05mg/ml), (c) von Topographie und (d) von Anerkennungsbildern wurden in der gleichen Stellung mit der gleichen freitragenden Spitze gemessen, die beträchtliche Reduzierung von Anerkennungsstellen zeigte. Alle Bilder wurden bei einer freitragenden Schwingungszahl 8.37kHz, eine Amplitude ungefähr 50nm und mit einer Darstellungsdrehzahl von ungefähr 2.7μm/s. gemessen.

Zusammenfassung

Die völlig integrierte Kombination des Atomkraftmikroskops und umgekehrten der Lichtmikroskopfähigkeiten, die durch das Agilent 6000ILM FLUGHANDBUCH aktivierte geleistet wurden vor kurzem, eine einfache und schnelle Untersuchung der Verteilung der Zellmembranproteine an den Mikrometer- und nmschuppen. Das einfache und die bequeme Bedienung dieses neuen Instrumentes stellen es das bevorzugte Hilfsmittel von den Biologen und von den Biophysikern für zahlreiche zukünftige Anwendungen in der Biowissenschaft am nanoscale her, dadurch sie überbrücken sie die Welten von Optik und von Atomauflösung unter physiologischen Bedingungen.

Bezüge

1. Linda Wildling, Barbara Unterauer, Rong Zhu, Anne Rupprecht, Thomas Haselgrübler, Christ Rankl, Andreas Ebner, Doris Vater, Philipp Pollheimer, Elena E. Pohl, Peter Hinterdorfer und Hermann J. Gruber, „Verbinden von Fühlermolekülen mit Aminogruppen zu Amino-functionalized FLUGHANDBUCH neigt sich,“ Bioconjugate Chem 22 (2011): 1239-1248.
2. Julianisches Weghuber, Stefan Sunzenauer, Birgit Plochberger, Mario Brameshuber, Thomas Haselgrübler und Gerhard J. Schütz, „Zeitliche Auflösung von Proteinproteininteraktionen in der Live-zellenplasmamembran,“ Anales Bioanal Chem 397 (2010): 3339-3347.

Über Agilent-Technologien

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Date Added: May 17, 2012 | Updated: Jul 15, 2013

Last Update: 15. July 2013 16:03

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