Espectroscopia de la Fuerza y Proyección De Imagen Fluorescencia-Conducidas del Reconocimiento en las Células vía ILM/AFM

Temas Revestidos

Introducción
    Microscopia de Fluorescencia en Análisis de la Célula Viva
    Combinar métodos del AFM con Proyección De Imagen del Reconocimiento de la Fluorescencia
Reseña de Experimentos
Proteína Fluorescente Verde Asegurada de Glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GFP)
Moléculas CD4 Fundidas con la Proteína Fluorescente Amarilla (YFP)
Resumen
Referencias
Sobre las Tecnologías de Agilent

Introducción

Microscopia de Fluorescencia en Análisis de la Célula Viva

La microscopia de Fluorescencia se ha convertido en una herramienta importante para localizar acciones recíprocas del receptor/del ligand en células vivas. La Etiqueta diversas de proteínas con diversos fluorophores espectrales permite la proyección de imagen de diversos componentes y de la determinación celulares, subcelulares, o moleculares de la localización específica de las proteínas en células. El rechazo de indeseado, antecedentes de la corto-longitud de onda (Difusión de Rayleigh de la luz de la excitación) por la filtración espectral mejora el contraste de estructuras celulares específicamente etiqueta en microscopia de fluorescencia. Las resoluciones laterales y axiles son limitadas por el límite de difracción de luz y de resultado en la resolución de ~200nm. Recientemente, las técnicas con más de alta resolución se han desarrollado, por ejemplo el agotamiento de la emisión estimulada (STED), foto-activaron microscopia de la localización (PALM), y la microscopia óptica estocástica de la reconstrucción (TORMENTA), que logran la resolución lateral de 10-30nm.

Combinar métodos del AFM con Proyección De Imagen del Reconocimiento de la Fluorescencia

Las técnicas Ópticas, sin embargo, no pueden proporcionar a ninguna información de la topografía de la muestra. Por El Contrario, la microscopia atómica de la fuerza (AFM) permite que las imágenes topográficas sean obtenidas en la escala del nanómetro en ambientes líquidos y en la temperatura ambiente. Además, el reconocimiento del receptor/de los pares del ligand se puede investigar en el nivel de la único-molécula.

Una técnica de proyección de imagen simultánea recientemente desarrollada de la topografía y del reconocimiento, realizada utilizando PicoTREC de las Tecnologías de Agilent para el trabajo detallado adjunto, es capaz de rendir una imagen topográfica así como una correspondencia de los sitios de reconocimiento de la misma área con una única exploración en la resolución del lateral 5nm. El principio del funcionamiento de la nueva técnica es lo mismo que para la proyección de imagen dinámica del AFM del modo. Un voladizo se oscila cerca de su frecuencia de la resonancia y se explora sobre la superficie de la muestra, pero en este caso el voladizo es hecho químicamente sensible asociando un ligand vía una máquina para hacer chorizos corta a su punta. Los puntos de enlace son evidentes de la reducción de la amplitud de la oscilación. El tratamiento de señales Aumentado, conjuntamente con un bucle de retroalimentación modificado, proporciona a una imagen del reconocimiento detectada simultáneamente junto a una imagen de la topografía.

Esencialmente, la separación de acciones topográficas y del reconocimiento es lograda partiendo la amplitud de la oscilación del voladizo en partes más inferiores y superiores (en cuanto a la posición que descansa del voladizo). Los máximos de estas piezas entonces se utilizan para registrar la topografía (partes más inferiores) y la imagen del reconocimiento (partes superiores) al mismo tiempo.

Este artículo discute la capacidad del microscopio atómico de la fuerza de Agilent 6000ILM de colocar fácilmente la punta del AFM a las regiones de interés usando una imagen óptica contraste-aumentada y una imagen de la fluorescencia, y la espectroscopia subsiguiente de la proyección de imagen y de la fuerza de TREC, que muestran la alta correlación entre intensidad de la fluorescencia, probabilidad obligatoria, y área del reconocimiento, así como la visualización de los nanodomains reconocidos en las células con diversos niveles de expresión de la proteína.

Reseña de Experimentos

Uno de los temas más intrigantes de ciencias de la vida y del bionanotechnology es la investigación de células y de la organización y función de proteínas en la membrana celular. La transmisión de señales de la Célula, la comunicación a las células vecinas, y el transporte al tejido adyacente se ordena todo a través de las proteínas de la membrana. Dos ejemplos de los sistemas importantes de la proteína para la transmisión de señales de la célula y la organización de la membrana celular se presentan aquí.

Los experimentos del AFM fueron realizados usando un Agilent 6000ILM AFM montado en un Observador A1 (para la medición de células con GPI-GFP) o a de Zeiss Axio HASTA el microscopio de Photonicsfluorescence (para la medición de células con YFP-CD4). Todas Las imágenes fueron detectadas en PBS en la temperatura ambiente usando el Modo del MAC de Agilent (es decir, CA magnética). El tipo VI y VII de Agilent las Palancas del MAC fue utilizado y las imágenes del AFM fueron detectadas usando el software de Agilent PicoView. Los Voladizos para la espectroscopia de la fuerza fueron lavados en cloroformo tres veces, secadas en el aire, lavado en la piraña (el 30% HO y22 el 70% HSO)2 para4 el minuto 30, enjuagado con agua, y secado calentando en los Voladizos 100°C. para la proyección de imagen de TREC fueron lavados en cloroformo tres veces y secados en aire. Todos Los voladizos después fueron tratados con APTES, conjugaron con el aldehido de NHS-PEG- o el NHS-ESPIGA-acetal, y conectaron posteriormente al anticuerpo [1].

Proteína Fluorescente Verde Asegurada de Glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GFP)

En la membrana de plasma de células, hay colesterol y los dominios sphingolipid-enriquecidos, llamados lípido del ` transportan en balsa'. Estos balsas del lípido sirven como centros de ordenación para el ensamblaje de las moléculas de la transmisión de señales, influencian fluidez de la membrana y la proteína de la membrana traficando, y también influencian el tráfico del receptor. Por ejemplo, sobre accionar específico, los receptores de la membrana tales como receptores del Linfocito T o receptores del Linfocito B desplazan en balsas del lípido, que es el requisito previo para la transducción receptor-mediada eficiente de la señal.

El Agilent 6000ILM AFM permitió la investigación de la morfología y de la distribución de los balsas del lípido en las células. Para esto, células T24 (células humanas del carcinoma del diafragma) - que transfected para expresar el ancla derivada de la DAF fundida a GFP [llamado GPI- (DAF) - GFP], una etiqueta de plástico altamente efectiva del balsa del lípido [2] de GPI - fueron crecidos en Placas de Petri de la cristal-parte inferior. Antes de proyección de imagen, las células fueron reparadas con el paraformaldehido del 4% por 30 Min.

La imagen topográfica (Figure1A) de las células fue obtenida usando Modo del MAC de Agilent. La fuerza de la proyección de imagen era tan apacible que los filamentos del citoesqueleto por debajo la membrana de plasma pueden ser vistos apenas. Lamellipodia en la banda de la célula, sin embargo, puede ser detectado sin obstrucción. El nivel de GPI- (DAF) - expresión de GFP en las células fue examinado obteniendo las imágenes de la fluorescencia de GFP (Figure1B).

Cuadro 1. (a) topografía del AFM de las células fijas T24 que expresan GPI-GFP (talla de la imagen: los 50μm). La imagen fue medida con Modo del MAC en PBS usando un tipo Palanca de Agilent del MAC de VI que oscilaba en 16kHz y aproximadamente 7nm con una velocidad de la proyección de imagen de 15μm/s. La fuerza de la proyección de imagen era tan apacible que los filamentos del citoesqueleto por debajo la membrana de plasma pueden ser vistos apenas. Lamellipodia en la banda de la célula, sin embargo, puede ser detectado sin obstrucción. (b) Imagen de la Fluorescencia (conjunto del filtro de FITC, magnificación de 100 x) de las mismas células que muestran el nivel de la expresión de GPI-GFP. Algunas regiones brillantes cerca del núcleo indican el retículo endoplásmico (ER), donde se sintetizan las proteínas GPI-aseguradas. Más Allá de las regiones del ER, la distribución de GPI-GFP en la membrana de plasma parece homogénea, a excepción de varios puntos brillantes (e.g., ésos en el cuadrado rojo). (c) Usando el voladizo functionalized con el anticuerpo anti-GFP, la imagen del reconocimiento de la región marcada con el cuadrado rojo en (b) reveló nanodomains con una talla alrededor de 200-300nm. En la región marcada con el círculo azul rayado, se han agregado los nanodomains, que correlaciona bien al microdomain mostrado en la imagen de la fluorescencia. Durante la proyección de imagen del reconocimiento, el voladizo oscilaba en 16 kilociclos y aproximadamente 7nm con una velocidad de la proyección de imagen de la talla de la Imagen 6.5μm/s.: los 5μm.

Cerca del núcleo de las células hay algunas regiones con la intensidad muy alta de la fluorescencia, que es de acuerdo con el hecho de que las proteínas GPI-aseguradas están sintetizadas en el retículo endoplásmico (ER) que rodea el núcleo de las células (véase el Cuadro 2). Más Allá de las regiones del ER, no hay correlación entre la altura topográfica y la intensidad de la fluorescencia, que sugiere que la mayor parte del GPI- (DAF) - moléculas de GFP está situada en la membrana de plasma bastante que en el cytosol. De Vez En Cuando, algunos puntos brillantes de la fluorescencia se pueden encontrar lejos de la región del ER, según lo marcado con el cuadrado rojo (Figure1B). Tales puntos brillantes pueden ser vesícula en el cytosol o microdomain en la membrana de plasma. La microscopia de fluorescencia convencional con la magnificación más alta (100x) muestra Generalmente una distribución homogénea de GPI- (DAF) - GFP en la membrana de plasma.

Cuadro 2. diagrama Esquemático de la microscopia óptica y atómica combinada de la fuerza para las mediciones del reconocimiento en la célula. GFP GPI-asegurado se sintetiza en el ER, se modifica en Golgi, y se transporta vía las vesículas a la membrana de plasma. Mientras Que el microscopio óptico puede examinar la distribución total del nivel y de la micrómetro-escala de la expresión de GPI-GFP con la medición de la fluorescencia, la proyección de imagen del reconocimiento por el voladizo del anticuerpo-functionalized puede visualizar la distribución de GPI-GFP en la escala del nanómetro. Para la proyección de imagen del reconocimiento, el voladizo oscila en la amplitud constante. Cuando el anticuerpo en la punta ata con el GFP en la superficie de la célula, la parte superior de la onda de la oscilación se reduce. Esto se puede detectar por el rectángulo de Agilent PicoTREC, donde la onda de la oscilación está partida en partes superiores y más inferiores. La parte superior de la onda de la oscilación se utiliza para construir la imagen del reconocimiento. Aquí, las acciones del reconocimiento se muestran en rojo.

Para investigar la distribución de GPI- (DAF) - GFP en el nivel del nanómetro, la proyección de imagen de TREC fue utilizada. El principio de la proyección de imagen de TREC usando una punta voladiza functionalized con el anticuerpo anti-GFP se muestra en el Cuadro 2. Durante proyección de imagen, el voladizo oscila (impulsado por un campo magnético) en una amplitud constante. Cuando el anticuerpo en la punta ata con el GFP en la superficie de la célula, la parte superior de la oscilación se reduce. Esto se puede detectar por el rectángulo de Agilent PicoTREC, donde la onda de la oscilación está partida en partes superiores y más inferiores. De la parte superior de la onda de la oscilación, la imagen del reconocimiento puede ser construida; el área con una acción obligatoria se muestra como mancha oscura.

La imagen del reconocimiento de la región marcada con el cuadrado rojo en Figure1B se muestra en la Figura 1C. De la imagen del reconocimiento, puede ser visto que el GPI- (DAF) - moléculas de GFP forma nanodomains con una talla alrededor de 200-300nm. En la región marcada con el círculo azul rayado, se han agregado los nanodomains, que parece un microdomain en la imagen de la fluorescencia. Tal microdomain proporciona a un puente único para mostrar la correlación entre la fluorescencia y las imágenes del reconocimiento.

Moléculas CD4 Fundidas con la Proteína Fluorescente Amarilla (YFP)

CD4 (atado de la diferenciación 4), una glicoproteína encontrada originalmente en la superficie de las células de ayudante de T, juegos un papel muy importante en inmunología y la enfermedad del VIH. La distribución de la proteína CD4 fue investigada en las células T24 que transfected para expresar CD4 YFP-fundido. Tales células eran fijas y reflejadas usando microscopia de fluorescencia y el AFM. De la imagen y de la imagen de la fluorescencia (Figuras 3A y 3B) del brightfield, fue encontrado que algunas de las células (e.g., la célula 1 en el Cuadro 3) tiene alta expresión de YFP-CD4, mientras que algunas otras células (e.g., la célula 2 en el Cuadro 3) tiene expresión muy inferior.

El Cuadro 3. (a) imagen de Brightfield y (b) imagen de la fluorescencia de las células fijas T24 transfected con YFP-CD4 revela que algunas de las células (e.g., la célula 1) tiene alta expresión de YFP-CD4, mientras que algunas otras células (e.g., la célula 2) tiene expresión muy inferior. Con la dirección de las imágenes ópticas, la espectroscopia de la fuerza y la proyección de imagen del reconocimiento fueron realizadas en la célula 1 y la célula 2. En la célula 1, 244 curvas de la fuerza-distancia fueron medidas, de las cuales 220 acciones obligatorias de la demostración de las curvas, dando por resultado una probabilidad obligatoria de 90,2%. (F-I) Las imágenes de la topografía y del reconocimiento del AFM medidas en la célula 1 y la célula 2 con un tipo Palanca de Agilent del MAC de VII functionalized con el anticuerpo anti-CD4. Las Imágenes en las dos células fueron medidas con la misma punta en la misma frecuencia (8kHz) y amplitud (sobre 50nm) con una velocidad de la proyección de imagen alrededor 1.9μm/s. de la Célula 1 (el panel H) mostró muchas manchas grandes del reconocimiento con una talla que colocaba a partir del 100 a 200nm, mientras que la célula 2 (panel I) mostró manchas mucho más pequeñas con una distancia más lejana.

Con la dirección de las imágenes ópticas, la espectroscopia de la fuerza y la proyección de imagen del reconocimiento fueron realizadas en las células 1 y 2. Para estas mediciones, las puntas voladizas functionalized con el anticuerpo anti-CD4. En la célula 1, 244 curvas de la fuerza-distancia fueron medidas, de las cuales 220 acciones obligatorias de la demostración de las curvas, dando por resultado una probabilidad obligatoria de 90,2% (Figura 3D). Una curva típica de la fuerza-distancia con una acción obligatoria se muestra en la Figura 3C. En la célula 2, 241 curvas de la distancia de la fuerza fueron medidas, de las cuales solamente 10 acciones obligatorias de la demostración de las curvas, dando por resultado una probabilidad obligatoria de 4,1%. Una curva típica de la fuerza-distancia sin una acción obligatoria se muestra en la Figura 3E. Las mediciones de la curva de la fuerza-distancia en las dos células fueron realizadas con la misma punta. La probabilidad Obligatoria para cells1 y 2 está en el acuerdo muy buen con la intensidad de la fluorescencia.

Las Figuras 3F a la demostración 3I las imágenes de la topografía y del reconocimiento del AFM medidas en Imágenes de las células 1 y 2. en estas dos células fueron medidas con la misma punta en la misma frecuencia y la amplitud. Fue encontrado que hay muchas manchas grandes del reconocimiento en la célula 1 (Figura 3H) con una talla que coloca a partir del 100 a 200nm. La mayor parte de las manchas del reconocimiento están situadas en regiones del agujero en la topografía, pero las manchas del reconocimiento se pueden también encontrar en regiones que resaltan en la topografía (Figura 3F).

Muchos de los nanodomains se conectan ya con uno a. Tal alta densidad de las manchas del reconocimiento coincide con la señal fuerte de la fluorescencia en la célula 1, y es idéntica con la alta probabilidad obligatoria de la espectroscopia de la fuerza. Por otra parte, las manchas del reconocimiento en la célula 2 (Figura 3I) son normalmente más pequeñas que ésas en la célula 1, y la distancia entre las manchas del reconocimiento son básicamente mayores que ésa en la célula 1. El área total de las manchas del reconocimiento en la célula 2 es mucho menos que eso en la célula 1, que correlaciona muy bien al nivel de la expresión revelador por la imagen de la fluorescencia.

Para examinar más lejos la especificidad de las manchas del reconocimiento, un experimento del bloque fue realizado inyectando el anticuerpo libre anti-CD4 en la solución de la medición. El Cuadro 4 muestra que la topografía de la membrana celular parecía similar después del bloque; sin embargo, las manchas del reconocimiento fueron reducidas importante por el anticuerpo libre inyectado. Para la proyección de imagen antes y después de que el bloque, el mismo voladizo fue utilizado en la misma frecuencia y amplitud de la oscilación. La reducción sin obstrucción de las manchas del reconocimiento confirmó la especificidad de los nanodomains reconocimiento-proyección de imagen-reveladores CD4.

El Cuadro 4. (a) Topografía y (b) imágenes del reconocimiento en las células fijas T24 que expresaban YFP-CD4 antes del bloque, reflejado por el tipo Palanca de Agilent del Mac de VII functionalized con el anticuerpo anti-CD4. Cerca De 2,5 horas después de la inyección de las moléculas libres del anticuerpo anti-CD4 (con una concentración final de 0.05mg/ml), (c) de la topografía y (d) de las imágenes del reconocimiento fueron medidas en la misma posición con la misma punta voladiza, que mostró la reducción importante de las manchas del reconocimiento. Todas Las imágenes fueron medidas en una frecuencia voladiza de 8.37kHz, una amplitud de la oscilación alrededor de 50nm, y con una velocidad de la proyección de imagen alrededor de 2.7μm/s.

Resumen

La combinación completo integrada del microscopio atómico de la fuerza y de las capacidades invertidas del microscopio pálido permitidos por el Agilent 6000ILM AFM activó recientemente una investigación fácil y rápida de la distribución de las proteínas de la membrana celular en las escalas del micrómetro y del nanómetro. La operación simple y conveniente de este nuevo instrumento le hará la herramienta preferida de biólogos y de biofísicos para las aplicaciones futuras numerosas en ciencias de la vida en el nanoscale, de tal modo puenteando los mundos de las ópticas y de la resolución atómica bajo condiciones fisiológicas.

Referencias

1. Linda Wildling, Barbara Unterauer, Rong Zhu, Anne Rupprecht, Thomas Haselgrübler, Cristiano Rankl, Andreas Ebner, Doris Vater, Philipp Pollheimer, Elena E. Pohl, Peter Hinterdorfer, y Hermann J. Gruber, “Conexión de las moléculas del sensor a los grupos aminados al AFM amino-functionalized inclina,” Bioconjugate Chem 22 (2011): 1239-1248.
2. Weghuber Juliano, Stefan Sunzenauer, Birgit Plochberger, Mario Brameshuber, Thomas Haselgrübler, y Gerhard J. Schütz, “resolución Temporal de las acciones recíprocas de la proteína de la proteína en la membrana de plasma de la vivo-célula,” Bioanal Anal Chem 397 (2010): 3339-3347.

Sobre las Tecnologías de Agilent

los instrumentos de la nanotecnología le permiten imagen, manipulan, y caracterizan una amplia variedad de comportamientos del nanoscale - eléctricos, químicos, biológicos, moleculares, y atómicos. Nuestra colección cada vez mayor de instrumentos, de accesorios, de software, de servicios y de materiales de consumo de la nanotecnología puede revelar pistas que usted necesita entender el mundo del nanoscale.

Las Tecnologías de Agilent ofrecen una amplia gama de microscopios atómicos de alta precisión de la fuerza (AFM) para cubrir sus necesidades únicas de la investigación. Los instrumentos altamente configurables de Agilent permiten que usted despliegue las capacidades de sistema mientras que ocurren sus necesidades. Los sistemas ambientales industria-de cabeza de la temperatura de Agilent y la manipulación flúida activa el líquido superior y la proyección de imagen suave de los materiales. Las Aplicaciones incluyen ciencia material, la electroquímica, el polímero y aplicaciones de las ciencias de la vida.

Date Added: May 17, 2012 | Updated: Jul 15, 2013

Last Update: 15. July 2013 16:36

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