Spectroscopie de Force et Représentation Fluorescence-Guidées de Reconnaissance sur des Cellules par l'intermédiaire d'ILM/AFM

Parrainé par des Technologies de Keysight

Sujets Couverts

Introduction
    Microscopie à Fluorescence dans l'Analyse de Cellules Vivantes
    Combinaison des méthodes d'AFM avec la Représentation de Reconnaissance de Fluorescence
Synthèse des Expériences
Protéine Fluorescente Verte Ancrée de Glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GFP)
Molécules CD4 Fixées avec la Protéine Fluorescente Jaune (YFP)
Résumé
Références
Au Sujet des Technologies de Keysight

Introduction

Microscopie à Fluorescence dans l'Analyse de Cellules Vivantes

La Microscopie à fluorescence est devenue un outil important pour localiser des interactions de récepteur/ligand en cellules vivantes. L'Écriture De Labels différentes des protéines avec différents fluorophores spectraux permet la représentation des composants et de la détermination cellulaires, sous-cellulaires, ou moléculaires différents de la localisation particulière des protéines en cellules. Le refus du mouvement propre non désiré et à ondes courtes (Diffusion de Rayleigh de la lumière d'excitation) par le filtrage spectral améliore le contraste des structures cellulaires particulièrement étiquetées dans la microscopie à fluorescence. Les définitions transversales et axiales sont limitées par la limite de diffraction de la lumière et du résultat dans la définition de ~200nm. Récent, des techniques avec plus de haute résolution ont été développées, comme l'épuisement d'émission stimulée (STED), photo-ont lancé la microscopie de localisation (PALM), et la microscopie optique stochastique de reconstruction (TEMPÊTE), qui réalisent la définition transversale de 10-30nm.

Combinaison des méthodes d'AFM avec la Représentation de Reconnaissance de Fluorescence

Les techniques Optiques, cependant, ne peuvent fournir aucune informations de la topographie d'échantillon. En Revanche, la microscopie atomique de force (AFM) permet à des images topographiques d'être obtenues à l'échelle de nanomètre dans les environnements liquides et à la température ambiante. De plus, la reconnaissance du récepteur/des paires de ligand peut être vérifiée au niveau d'unique-molécule.

Une topographie et une technique d'imagerie simultanées développées récemment de reconnaissance, exécutée employant PicoTREC des Technologies de Keysight pour le travail détaillé dans le présent, est capable de fournir une image topographique ainsi qu'un plan des sites de reconnaissance de la même zone avec un au premier balayage à la définition de la partie latérale 5nm. Le principe du fonctionnement de la technique neuve est le même que pour la représentation dynamique d'AFM de mode. Un encorbellement est oscillé près de sa fréquence de résonance et balayé au-dessus de la surface témoin, mais dans ce cas l'encorbellement est rendu chimiquement sensible en fixant un ligand par l'intermédiaire d'un éditeur de liens court à son extrémité. Les accepteurs sont évidents de la réduction d'amplitude de vibration. Le traitement du signal Amélioré, en combination avec une boucle de contre-réaction modifiée, fournit une image de reconnaissance simultanément saisie à côté d'une image de topographie.

Essentiellement, la séparation des événements topographiques et de reconnaissance est réalisée en divisant l'amplitude de la vibration de l'encorbellement dans inférieur et des parties supérieures (en ce qui concerne la position posante de l'encorbellement). Les maxima de ces pièces sont alors employés pour enregistrer la topographie (des parties plus inférieures) et l'image de reconnaissance (parties supérieures) en même temps.

Cet article discute la capacité du microscope atomique de force de Keysight 6000ILM de positionner facilement l'extrémité d'AFM aux régions d'intérêt utilisant une image optique contraste-améliorée et une image de fluorescence, et la spectroscopie ultérieure de représentation et de force de TREC, qui affichent la corrélation élevée parmi l'intensité de fluorescence, la probabilité obligatoire, et la zone de reconnaissance, ainsi que la visualisation des nanodomains identifiés sur des cellules avec différents niveaux d'expression de la protéine.

Synthèse des Expériences

Un des sujets les plus intrigants dans les sciences de la vie et le bionanotechnology est l'enquête sur les cellules et l'organisme et fonctionnement des protéines dans la membrane cellulaire. La signalisation de Cellules, la transmission aux cellules voisines, et le transport au tissu adjacent est tout dispensée par des protéines de membrane. Deux exemples des systèmes importants de protéine pour la signalisation de cellules et l'organisme de membrane cellulaire sont présentés ici.

Des expériences d'AFM ont été effectuées utilisant un Keysight 6000ILM AFM monté sur un Observateur de Zeiss Axio A1 (pour la mesure des cellules avec GPI-GFP) ou a JUSQU'au microscope de Photonicsfluorescence (pour la mesure des cellules avec YFP-CD4). Toutes Les images ont été saisies dans PBS à la température ambiante utilisant le Mode de Keysight MAC (c.-à-d., COURANT ALTERNATIF magnétique). Le type VI et VII de Keysight des Manettes de MAC ont été employés et des images d'AFM ont été saisies utilisant le logiciel de Keysight PicoView. Des Encorbellements pour la spectroscopie de force ont été lavés en chloroforme trois fois, sèches en air, lavé dans le piranha (30% HO et22 70% HSO)2 pour4 mn 30, rincé avec de l'eau, et sec par la chauffage aux Encorbellements 100°C. pour la représentation de TREC ont été lavés en chloroforme trois fois et séchés en air. Tous Les encorbellements ont été alors traités avec APTES, ont conjugué avec de l'aldéhyde de NHS-PEG- ou le NHS-ANCRAGE-acétal, et ultérieurement ont joint avec de l'anticorps [1].

Protéine Fluorescente Verte Ancrée de Glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GFP)

Dans la membrane de plasma des cellules, il y a de cholestérol et les domaines sphingolipid-enrichis, nommés lipide de ` transporte par radeau'. Ces radeaux de lipide servent de centres dispensants à l'assemblage des molécules de signalisation, influencent la fluidité de membrane et la protéine de membrane trafiquant, et influencent également le trafic de récepteur. Par exemple, sur le déclenchement particulier, les récepteurs de membrane tels que des récepteurs de Récepteurs des lymphocytes T ou de Lymphocyte B transfèrent dans des radeaux de lipide, qui est le préalable à la transduction du signal récepteur-assistée efficace.

Le Keysight 6000ILM AFM a permis l'enquête sur la morphologie et la distribution des radeaux de lipide sur des cellules. Pour ceci, cellules T24 (cellules humaines de carcinome de la vessie) - qui étaient transfecté pour exprimer le point d'attache de GPI dérivé de la DAF fixée au GFP [nommé GPI- (DAF) - GFP], un repère hautement pertinent de radeau de lipide [2] - ont été développés sur des boîtes de Pétri De glace-bas. Avant la représentation, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde de 4% pendant 30 Mn.

L'image topographique (Figure1A) des cellules a été obtenue utilisant le Mode de Keysight MAC. La force de représentation était si douce que les filaments du cytosquelette sous la membrane de plasma puissent à peine être vus. Lamellipodia au cadre de cellules, cependant, peut être de manière dégagée trouvé. Le niveau de GPI- (DAF) - expression de GFP dans les cellules a été examiné en obtenant les images de fluorescence de GFP (Figure1B).

Le Schéma 1. (a) topographie d'AFM des cellules T24 fixes exprimant GPI-GFP (taille de l'image : 50μm). L'image a été mesurée avec le Mode de MAC dans PBS à l'aide d'un type Manette de Keysight de VI MAC oscillant à 16kHz et à environ à 7nm avec une vitesse de représentation de 15μm/s. La force de représentation était si douce que les filaments du cytosquelette sous la membrane de plasma puissent à peine être vus. Lamellipodia au cadre de cellules, cependant, peut être de manière dégagée trouvé. (b) Image de Fluorescence (positionnement de filtre de FITC, agrandissement de 100 x) des mêmes cellules affichant le niveau d'expression de GPI-GFP. Quelques régions lumineuses près du noyau indiquent le réticulum endoplasmique (ER), où les protéines GPI-ancrées sont synthétisées. Au Delà des régions d'ER, la distribution de GPI-GFP dans la membrane de plasma semble homogène, excepté plusieurs points lumineux (par exemple, ceux dans le carré rouge). (c) À l'aide de l'encorbellement functionalized avec de l'anticorps anti-GFP, l'image de reconnaissance de la région par le carré rouge en (b) a indiqué des nanodomains avec une taille environ de 200-300nm. Dans la région par le cercle bleu à tiret, les nanodomains ont été totalisés, qui marque bien avec le microdomain affiché dans l'image de fluorescence. Pendant la représentation de reconnaissance, l'encorbellement oscillait à 16 kilohertz et à environ 7nm avec une vitesse de représentation de la Taille de l'image 6.5μm/s. : 5μm.

Près du noyau des cellules il y a quelques régions avec l'intensité très élevée de fluorescence, qui est conforme au fait que les protéines GPI-ancrées sont synthétisées dans le réticulum endoplasmique (ER) entourant le noyau des cellules (voir le Schéma 2). Au Delà des régions d'ER, il n'y a aucune corrélation entre la hauteur topographique et l'intensité de fluorescence, qui suggère que la majeure partie du GPI- (DAF) - molécules de GFP est située dans la membrane de plasma plutôt que dans le cytosol. De Temps En Temps, quelques points lumineux de fluorescence peuvent être trouvés loin de la région d'ER, comme par le carré rouge (Figure1B). De Tels points lumineux peuvent être vésicule dans le cytosol ou microdomain dans la membrane de plasma. Généralement la microscopie à fluorescence conventionnelle avec l'agrandissement le plus élevé (100x) affiche une distribution homogène de GPI- (DAF) - GFP dans la membrane de plasma.

Le Schéma 2. schéma de principe De la microscopie optique et atomique combinée de force pour des mesures de reconnaissance sur la cellule. le GFP GPI-ancré est synthétisé dans l'ER, modifié dans Golgi, et transporté par l'intermédiaire des vésicules à la membrane de plasma. Tandis Que le microscope optique peut examiner la distribution générale de niveau d'expression et de micromètre-échelle de GPI-GFP par la mesure de fluorescence, la représentation de reconnaissance par l'encorbellement d'anticorps-functionalized peut concevoir la distribution de GPI-GFP à l'échelle de nanomètre. Pour la représentation de reconnaissance, l'encorbellement oscille à l'amplitude constante. Quand l'anticorps sur l'extrémité grippe avec le GFP sur la surface de cellules, la partie supérieure de l'onde de vibration est réduite. Ceci peut être trouvé par le cadre de Keysight PicoTREC, où l'onde de vibration est coupée en parties supérieures et plus inférieures. La partie supérieure de l'onde de vibration est habituée pour construire l'image de reconnaissance. Ici, des événements de reconnaissance sont affichés en rouge.

Pour vérifier la distribution de GPI- (DAF) - GFP au niveau de nanomètre, la représentation de TREC a été employée. Le principe de la représentation de TREC utilisant une extrémité en porte-à-faux functionalized avec de l'anticorps anti-GFP est affiché sur le Schéma 2. Pendant la représentation, l'encorbellement oscille (piloté par un champ magnétique) à une amplitude constante. Quand l'anticorps sur l'extrémité grippe avec le GFP sur la surface de cellules, la partie supérieure de la vibration est réduite. Ceci peut être trouvé par le cadre de Keysight PicoTREC, où l'onde de vibration est coupée en parties supérieures et plus inférieures. De la partie supérieure de l'onde de vibration, l'image de reconnaissance peut être construite ; la zone avec un événement obligatoire est affichée comme tache brune.

L'image de reconnaissance de la région par le carré rouge dans Figure1B est affichée dans la Figure 1C. De l'image de reconnaissance, il peut voir que le GPI- (DAF) - molécules de GFP forment des nanodomains avec une taille environ de 200-300nm. Dans la région par le cercle bleu à tiret, les nanodomains ont été totalisés, qui ressemble à un microdomain dans l'image de fluorescence. Un Tel microdomain fournit une seule passerelle pour afficher la corrélation entre la fluorescence et les images de reconnaissance.

Molécules CD4 Fixées avec la Protéine Fluorescente Jaune (YFP)

CD4 (batterie de différenciation 4), une glycoprotéine initialement trouvée sur la surface des cellules d'assistant de T, jeux très un rôle majeur en immunologie et la maladie du VIH. La distribution de la protéine CD4 a été vérifiée sur les cellules T24 qui étaient transfecté pour exprimer le CD4 YFP-fixé. De Telles cellules étaient fixes et imagées à l'aide de la microscopie à fluorescence et de l'AFM. De l'image de brightfield et de l'image de fluorescence (Figures 3A et 3B), on l'a constaté que certaines des cellules (par exemple, la cellule 1 sur le Schéma 3) ont l'expression élevée de YFP-CD4, alors que quelques autres cellules (par exemple, la cellule 2 sur le Schéma 3) ont l'expression très faible.

Le Schéma 3. (a) image de Brightfield et (b) image de fluorescence de transfecté fixe des cellules T24 avec YFP-CD4 indiquent que certaines des cellules (par exemple, la cellule 1) ont l'expression élevée de YFP-CD4, alors que quelques autres cellules (par exemple, la cellule 2) ont l'expression très faible. Avec l'orientation des images optiques, la spectroscopie de force et la représentation de reconnaissance ont été exécutées sur la cellule 1 et la cellule 2. Sur la cellule 1, 244 courbures de force-distance dont ont été mesurées, 220 événements obligatoires d'exposition de courbures, ayant pour résultat une probabilité obligatoire de 90,2%. (Fi) Les images de topographie et de reconnaissance d'AFM mesurées sur la cellule 1 et la cellule 2 avec un type Manette de Keysight de VII MAC functionalized avec de l'anticorps anti-CD4. Des Images sur les deux cellules ont été mesurées avec la même extrémité à la même fréquence (8kHz) et à l'amplitude (au sujet de 50nm) avec une vitesse de représentation environ 1.9μm/s. de la Cellule 1 (la Commission H) a affiché beaucoup de grands endroits de reconnaissance avec une taille s'échelonnant de 100 à 200nm, alors que la cellule 2 (la Commission I) a affiché des endroits beaucoup plus petits avec une distance plus lointaine.

Avec l'orientation des images optiques, la spectroscopie de force et la représentation de reconnaissance ont été exécutées sur les cellules 1 et 2. Pour ces mesures, les extrémités en porte-à-faux functionalized avec de l'anticorps anti-CD4. Sur la cellule 1, 244 courbures de force-distance dont ont été mesurées, 220 événements obligatoires d'exposition de courbures, ayant pour résultat une probabilité obligatoire de 90,2% (Figure 3D). Une courbure typique de force-distance avec un événement obligatoire est affichée dans la Figure 3C. Sur la cellule 2, 241 courbures de distance de force dont ont été mesurées, seulement 10 événements obligatoires d'exposition de courbures, ayant pour résultat une probabilité obligatoire de 4,1%. Une courbure typique de force-distance sans événement obligatoire est affichée dans la Figure 3E. Les mesures de courbure de force-distance sur les deux cellules ont été exécutées avec la même extrémité. La probabilité Obligatoire pour cells1 et 2 est dans la concordance très bonne avec l'intensité de fluorescence.

Les Figures 3F à la montr 3I les images de topographie et de reconnaissance d'AFM mesurées sur des Images des cellules 1 et 2. sur ces deux cellules ont été mesurées avec la même extrémité à la même fréquence et à l'amplitude. On l'a constaté qu'il y a beaucoup de grands endroits de reconnaissance sur la cellule 1 (Figure 3H) avec une taille s'échelonnant de 100 à 200nm. La Plupart des endroits de reconnaissance sont situées dans des régions de trou en topographie, mais des endroits de reconnaissance peuvent également être trouvés dans des régions saillantes en topographie (Figure 3F).

Plusieurs des nanodomains sont déjà connectés les uns avec les autres. Une Telle haute densité d'endroits de reconnaissance coïncide avec le signe intense de fluorescence sur la cellule 1, et est identique à la probabilité obligatoire élevée de la spectroscopie de force. D'autre part, les endroits de reconnaissance sur la cellule 2 (Figure 3I) sont normalement plus petits que ceux sur la cellule 1, et la distance entre les endroits de reconnaissance est fondamentalement plus grand que celui sur la cellule 1. La zone générale des endroits de reconnaissance sur la cellule 2 est beaucoup moins que cela sur la cellule 1, qui marque très bien avec le niveau d'expression indiqué par l'image de fluorescence.

Pour examiner plus plus loin la spécificité des endroits de reconnaissance, une expérience de case a été effectuée en injectant l'anticorps anti-CD4 libre dans la solution de mesure. Le Schéma 4 prouve que la topographie de la membrane cellulaire a semblé assimilée après la case ; cependant, les endroits de reconnaissance étaient sensiblement réduits par l'anticorps libre injecté. Pour la représentation avant et après que la case, le même encorbellement ait été utilisée à la mêmes fréquence et amplitude de vibration. La réduction dégagée des endroits de reconnaissance a confirmé la spécificité des nanodomains CD4 reconnaissance-représentation-indiqués.

Le Schéma 4. (a) Topographie et (b) images de reconnaissance sur les cellules T24 fixes exprimant YFP-CD4 avant la case, imagée par le type Manette de Keysight de VII Mac functionalized avec de l'anticorps anti-CD4. Environ 2,5 heures après injection des molécules libres de l'anticorps anti-CD4 (avec une concentration finale de 0.05mg/ml), (c) de la topographie et (d) des images de reconnaissance ont été mesurées à la même position avec la même extrémité en porte-à-faux, qui a révélé la réduction significative des endroits de reconnaissance. Toutes Les images ont été mesurées à une fréquence en porte-à-faux de vibration de 8.37kHz, une amplitude environ de 50nm, et avec une vitesse de représentation environ de 2.7μm/s.

Résumé

La combinaison entièrement intégrée du microscope atomique de force et des capacités inversées de photomicroscope accordés par le Keysight 6000ILM AFM a récent activé une enquête facile et rapide sur la distribution des protéines de membrane cellulaire aux échelles de micromètre et de nanomètre. Le fonctionnement simple et pratique de cet instrument neuf lui effectuera l'outil préféré des biologistes et des biophysiciens pour de nombreuses futures applications en sciences de la vie au nanoscale, jetant un pont sur de ce fait les mondes des blocs optiques et de la définition atomique dans des conditions physiologiques.

Références

1. Linda Wildling, Barbara Unterauer, Rong Zhu, Anne Rupprecht, Thomas Haselgrübler, Chrétien Rankl, Andreas Ebner, Doris Vater, Philipp Pollheimer, Elena E. Pohl, Peter Hinterdorfer, et Hermann J. Gruber, « Joindre des molécules de senseur avec des groupes aminés à l'AFM aminé-functionalized dirige, » Bioconjugate Chem 22 (2011) : 1239-1248.
2. Julian Weghuber, Stefan Sunzenauer, Birgit Plochberger, Mario Brameshuber, Thomas Haselgrübler, et Gerhard J. Schütz, « définition Temporelle des interactions protéine-protéine dans la membrane de plasma de sous tension-cellule, » Bioanal Chem 397 Anal (2010) : 3339-3347.

Au Sujet des Technologies de Keysight

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Source : Technologies de Keysight

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Date Added: May 17, 2012 | Updated: Dec 16, 2014

Last Update: 16. December 2014 12:30

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