Spettroscopia della Forza & Rappresentazione Fluorescenza-Guida di Riconoscimento sulle Celle via ILM/AFM

Promosso dalle Tecnologie di Keysight

Argomenti Coperti

Introduzione
    Microscopia di Fluorescenza nell'Analisi delle Cellule Viventi
    Combinando i metodi del AFM con la Rappresentazione di Riconoscimento di Fluorescenza
Generalità degli Esperimenti
Proteina Fluorescente Verde Ancorata di Glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GFP)
Molecole CD4 Fuse con Proteina Fluorescente Gialla (YFP)
Riassunto
Riferimenti
Circa le Tecnologie di Keysight

Introduzione

Microscopia di Fluorescenza nell'Analisi delle Cellule Viventi

La microscopia di Fluorescenza si è trasformata in in uno strumento importante per la localizzazione delle interazioni legante/del ricevitore in celle viventi. Il Contrassegno delle proteine differenti con differenti fluorophores spettrali permette la rappresentazione delle componenti differenti e della determinazione cellulari, sottocellulari, o molecolari della localizzazione specifica delle proteine in celle. Il rifiuto dello sfondo indesiderato e a onde corte (Scattering Rayleigh dell'indicatore luminoso di eccitazione) dalla filtrazione spettrale migliora il contrasto delle strutture cellulari specificamente contrassegnate nella microscopia di fluorescenza. Le risoluzioni laterali ed assiali sono limitate dal limite di diffrazione di indicatore luminoso e del risultato nella risoluzione di ~200nm. Recentemente, le tecniche con più di alta risoluzione sono state sviluppate, quale svuotamento dell'emissione stimolata (STED), foto-hanno attivato la microscopia della localizzazione (PALM) e la microscopia ottica stocastica di ricostruzione (TEMPESTA), che raggiungono la risoluzione laterale di 10-30nm.

Combinando i metodi del AFM con la Rappresentazione di Riconoscimento di Fluorescenza

Le tecniche Ottiche, tuttavia, non possono fornire alcune informazioni della topografia del campione. Al Contrario, la microscopia atomica della forza (AFM) permette che le immagini topografiche siano ottenute al disgaggio di nanometro negli ambienti liquidi ed alla temperatura ambiente. Inoltre, il riconoscimento del ricevitore/paia del legante può essere studiato al livello della unico molecola.

Una tecnica di rappresentazione simultanea sviluppata di recente del riconoscimento e della topografia, eseguita utilizzando PicoTREC dalle Tecnologie di Keysight per il lavoro dettagliato qui, è capace di rendere un'immagine topografica come pure una mappa dei siti di riconoscimento della stessa area con una singola scansione a risoluzione di laterale 5nm. Il principio di funzionamento della nuova tecnica è lo stesso di per la rappresentazione dinamica del AFM del modo. Una trave a mensola è oscillata vicino alla sua frequenza di risonanza ed è scandita sopra la superficie del campione, ma in questo caso la trave a mensola è resa chimicamente sensibile fissando un legante tramite breve linker al suo suggerimento. Le sedi del legame sono evidenti dalla riduzione di ampiezza di oscillazione. Il trattamento Migliorato del segnale, congiuntamente ad un ciclo di feedback modificato, fornisce un'immagine del riconoscimento acquistata simultaneamente accanto ad un'immagine della topografia.

Essenzialmente, la separazione di eventi del riconoscimento e topografici è raggiunta spaccando l'ampiezza dell'oscillazione della trave a mensola in più basso e nelle parti superiori (riguardo alla posizione di riposo della trave a mensola). I massimi di queste parti poi sono usati per registrare la topografia (parti inferiori) e l'immagine del riconoscimento (parti superiori) allo stesso tempo.

Questo articolo discute la capacità del microscopio atomico della forza di Keysight 6000ILM di posizionare facilmente il suggerimento del AFM sulle regioni di interesse facendo uso di un'immagine ottica contrasto-migliorata e un'immagine della fluorescenza e la spettroscopia successiva della rappresentazione e della forza di TREC, che mostrano l'alta correlazione fra l'intensità della fluorescenza, probabilità obbligatoria e area del riconoscimento come pure la visualizzazione dei nanodomains riconosciuti sulle celle con differenti livelli di espressione della proteina.

Generalità degli Esperimenti

Uno degli argomenti più intriganti nelle scienze biologiche e in bionanotechnology è l'indagine sulle celle e sull'organizzazione e funzione delle proteine nella membrana cellulare. La segnalazione delle Cellule, la comunicazione alle celle vicine ed il trasporto al tessuto adiacente interamente è organizzata attraverso le proteine della membrana. Due esempi dei sistemi importanti della proteina per la segnalazione delle cellule e l'organizzazione della membrana cellulare sono presentati qui.

Gli esperimenti del AFM sono stati eseguiti facendo uso di un Keysight 6000ILM AFM montato su un Osservatore A1 (per la misura delle celle con GPI-GFP) o a di Zeiss Axio FINO al microscopio di Photonicsfluorescence (per la misura delle celle con YFP-CD4). Tutte Le immagini si sono acquistate in PBS alla temperatura ambiente facendo uso del Modo del MACKINTOSH di Keysight (cioè, CA magnetico). I tipi VI e VII di Keysight Leve del MACKINTOSH sono stati utilizzati e le immagini del AFM si sono acquistate facendo uso del software di Keysight PicoView. Le Travi A Mensola per la spettroscopia della forza sono state lavate in cloroformio tre volte, secche in aria, lavata in piranha (30% NOIOSO e22 70% HSO)2 per4 il minuto 30, risciacquato con acqua e secco riscaldando alle Travi A Mensola 100°C. per la rappresentazione di TREC sono stati lavati in cloroformio tre volte e sono stati asciugati in aria. Tutte Le travi a mensola poi sono state trattate con APTES, hanno coniugato con l'aldeide di NHS-PEG- o l'NHS-PARITÀ-acetale e successivamente si sono collegate con l'anticorpo [1].

Proteina Fluorescente Verde Ancorata di Glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GFP)

Nella membrana di plasma delle celle, c'è colesterolo ed i domini sphingolipid-arricchiti, definiti lipido del ` trasporta'. Queste zattere del lipido serviscono da centri d'organizzazione per il montaggio delle molecole di segnalazione, influenzano la fluidità della membrana e la proteina della membrana trafficante ed egualmente influenzano il traffico del ricevitore. Per esempio, sopra l'avviamento specifico, i ricevitori della membrana quali i ricevitori A Cellula T o i ricevitori del Linfocita B spostano nelle zattere del lipido, che è il presupposto per trasduzione ricevitore-mediata efficiente del segnale.

Il Keysight 6000ILM AFM ha permesso l'indagine sia sulla morfologia che sulla distribuzione delle zattere del lipido sulle celle. Per questo, T24 celle (celle umane di carcinoma della vescica) - che transfected per esprimere l'ancora derivata dal DAF fuso a GFP [definito GPI- (DAF) - GFP], un indicatore altamente efficace della zattera del lipido [2] di GPI - si sono sviluppati sulle capsule di Petri Del vetro-fondo. Prima della rappresentazione, le celle sono state fissate con il paraformaldeide di 4% per 30 Min.

L'immagine topografica (Figure1A) delle celle è stata ottenuta facendo uso del Modo del MACKINTOSH di Keysight. La forza della rappresentazione era così delicata che i filamenti del citoscheletro al di sotto della membrana di plasma possono appena essere veduti. Lamellipodia al confine delle cellule, tuttavia, può essere individuato chiaramente. Il livello di GPI- (DAF) - espressione di GFP nelle celle è stato esaminato ottenendo le immagini della fluorescenza di GFP (Figure1B).

Figura 1. (A) topografia del AFM delle celle fisse T24 che esprimono GPI-GFP (dimensioni immagine: 50μm). L'immagine è stata misurata con il Modo del MACKINTOSH in PBS usando un tipo Leva di Keysight del MACKINTOSH di VI che oscilla a 16kHz e circa a 7nm con velocità della rappresentazione di 15μm/s. La forza della rappresentazione era così delicata che i filamenti del citoscheletro al di sotto della membrana di plasma possono appena essere veduti. Lamellipodia al confine delle cellule, tuttavia, può essere individuato chiaramente. (B) immagine di Fluorescenza (insieme del filtro da FITC, un ingrandimento di 100 x) delle stesse celle che mostrano il livello di espressione di GPI-GFP. Alcune regioni luminose vicino al nucleo indicano il reticolo endoplasmatico (ER), in cui le proteine GPI-ancorate sono sintetizzate. Oltre le regioni di ER, la distribuzione di GPI-GFP nella membrana di plasma sembra omogenea, eccezione fatta per parecchi punti luminosi (per esempio, quelli in rosso quadrato). (C) Usando la trave a mensola functionalized con l'anticorpo anti--GFP, l'immagine di riconoscimento della regione segnata con il quadrato rosso dentro (B) ha rivelato i nanodomains con una dimensione circa di 200-300nm. Nella regione segnata con il cerchio blu tratteggiato, i nanodomains sono stati cumulati, che correla bene al microdomain indicato nell'immagine della fluorescenza. Durante la rappresentazione del riconoscimento, la trave a mensola stava oscillando a 16 chilocicli e circa a 7nm con velocità della rappresentazione di Dimensioni immagine 6.5μm/s.: 5μm.

Vicino al nucleo delle celle ci sono alcune regioni con l'intensità molto alta della fluorescenza, che è conforme al fatto che le proteine GPI-ancorate sono sintetizzate nel reticolo endoplasmatico (ER) che circonda il nucleo delle celle (si veda Figura 2). Oltre le regioni di ER, non c'è correlazione fra l'altezza topografica e l'intensità della fluorescenza, che suggerisce che la maggior parte del GPI- (DAF) - molecole di GFP è situata nella membrana di plasma piuttosto che nel cytosol. Occasionalmente, alcuni punti luminosi della fluorescenza possono essere trovati lontano dalla regione di ER, come segnato con il quadrato rosso (Figure1B). Tali punti luminosi possono essere vescicola nel cytosol o microdomain nella membrana di plasma. La microscopia di fluorescenza convenzionale con il più alto ingrandimento (100x) mostra Generalmente una distribuzione omogenea di GPI- (DAF) - GFP nella membrana di plasma.

Figura 2. Rappresentazione schematica della microscopia ottica ed atomica combinata della forza per le misure di riconoscimento sulla cella. GFP GPI-ancorato è sintetizzato nel ER, è modificato in Golgi ed è trasportato tramite vescicole alla membrana di plasma. Mentre il microscopio ottico può esaminare la distribuzione globale del livello e del micrometro-disgaggio di espressione di GPI-GFP con la misura della fluorescenza, la rappresentazione del riconoscimento dalla trave a mensola dell'anticorpo-functionalized può prevedere la distribuzione di GPI-GFP al disgaggio di nanometro. Per la rappresentazione del riconoscimento, la trave a mensola oscilla ad ampiezza costante. Quando l'anticorpo sul suggerimento lega con il GFP sulla superficie delle cellule, la parte superiore dell'onda di oscillazione è diminuita. Ciò può essere individuata dalla casella di Keysight PicoTREC, in cui l'onda di oscillazione è divisa in tomaia e parti inferiori. La parte superiore dell'onda di oscillazione è usata per costruire l'immagine del riconoscimento. Qui, gli eventi del riconoscimento sono indicati nel rosso.

Per studiare la distribuzione di GPI- (DAF) - GFP al livello di nanometro, la rappresentazione di TREC è stata utilizzata. Il principio di rappresentazione di TREC facendo uso di un suggerimento a mensola functionalized con l'anticorpo anti--GFP è indicato nella Figura 2. Durante la rappresentazione, la trave a mensola oscilla (guidato da un campo magnetico) ad un'ampiezza costante. Quando l'anticorpo sul suggerimento lega con il GFP sulla superficie delle cellule, la parte superiore dell'oscillazione è diminuita. Ciò può essere individuata dalla casella di Keysight PicoTREC, in cui l'onda di oscillazione è divisa in tomaia e parti inferiori. Dalla parte superiore dell'onda di oscillazione, l'immagine del riconoscimento può essere costruita; l'area con un evento obbligatorio è indicata come punto scuro.

L'immagine del riconoscimento della regione segnata con il quadrato rosso in Figure1B è indicata nella la Figura 1C. Dall'immagine del riconoscimento, può essere veduto che il GPI- (DAF) - molecole di GFP forma i nanodomains con una dimensione circa di 200-300nm. Nella regione segnata con il cerchio blu tratteggiato, i nanodomains sono stati cumulati, che assomiglia ad un microdomain nell'immagine della fluorescenza. Un Tal microdomain fornisce un ponte unico per mostrare la correlazione fra la fluorescenza e le immagini del riconoscimento.

Molecole CD4 Fuse con Proteina Fluorescente Gialla (YFP)

CD4 (cluster di differenziazione 4), una glicoproteina originalmente trovata sulla superficie dei Linfociti T helper, giochi un ruolo molto importante in immunologia e la malattia del HIV. La distribuzione della proteina CD4 è stata studiata sulle celle T24 che transfected per esprimere CD4 YFP-fuso. Tali celle erano fisse ed imaged usando la microscopia di fluorescenza ed il AFM. Dall'immagine del brightfield e dall'immagine della fluorescenza (Figure 3A e 3B), è stato trovato che alcune delle celle (per esempio, la cella 1 nella Figura 3) ha alta espressione di YFP-CD4, mentre alcune altre celle (per esempio, la cella 2 nella Figura 3) ha espressione molto bassa.

Figura 3. (A) immagine di Brightfield e (B) l'immagine della fluorescenza delle celle fisse T24 transfected con YFP-CD4 rivela che alcune delle celle (per esempio, la cella 1) ha alta espressione di YFP-CD4, mentre alcune altre celle (per esempio, la cella 2) ha espressione molto bassa. Con l'orientamento delle immagini ottiche, la spettroscopia della forza e la rappresentazione del riconoscimento sono state eseguite sulla cella 1 e sulla cella 2. Sulla cella 1, 244 curve di forza-distanza sono state misurate, da cui 220 eventi obbligatori di manifestazione delle curve, con conseguente probabilità obbligatoria di 90,2%. (F-I) Le immagini della topografia e del riconoscimento del AFM misurate sulla cella 1 e sulla cella 2 con un tipo Leva di Keysight del MACKINTOSH di VII functionalized con l'anticorpo anti-CD4. Le Immagini sulle due celle sono state misurate con lo stesso suggerimento alla stessa frequenza (8kHz) ed all'ampiezza (circa 50nm) con velocità della rappresentazione circa 1.9μm/s. della Cella 1 (comitato H) ha mostrato molti grandi punti del riconoscimento con una dimensione che varia da 100 a 200nm, mentre cella 2 (comitato I) ha mostrato i punti molto più piccoli con la distanza più lontana.

Con l'orientamento delle immagini ottiche, la spettroscopia della forza e la rappresentazione del riconoscimento sono state eseguite sulle celle 1 e 2. Per queste misure, i suggerimenti a mensola functionalized con l'anticorpo anti-CD4. Sulla cella 1, 244 curve di forza-distanza sono state misurate, da cui 220 eventi obbligatori di manifestazione delle curve, con conseguente probabilità obbligatoria di 90,2% (Figura 3D). Una curva tipica di forza-distanza con un evento obbligatorio è indicata nella la Figura 3C. Sulla cella 2, 241 curva di distanza della forza è stata misurata, da cui soltanto 10 eventi obbligatori di manifestazione delle curve, con conseguente probabilità obbligatoria di 4,1%. Una curva tipica di forza-distanza senza un evento obbligatorio è indicata nella la Figura 3E. Le misure della curva di forza-distanza sulle due celle sono state realizzate con lo stesso suggerimento. La probabilità Obbligatoria per cells1 e 2 è nell'accordo molto buono con l'intensità della fluorescenza.

Le Figure 3F alla manifestazione 3I le immagini della topografia e del riconoscimento del AFM misurate sulle Immagini delle cellule 1 e 2. su queste due celle sono state misurate con lo stesso suggerimento alla stessa frequenza ed all'ampiezza. È stato trovato che ci sono molti grandi punti del riconoscimento sulla cella 1 (Figura 3H) con una dimensione che varia da 100 a 200nm. La Maggior Parte dei punti del riconoscimento sono situati nelle regioni del foro in topografia, ma i punti del riconoscimento possono anche essere trovati nelle regioni di sporgenza in topografia (Figura 3F).

Molti dei nanodomains già sono connessi a vicenda. Un'Tal alta densità dei punti del riconoscimento coincide con il forte segnale della fluorescenza sulla cella 1 ed è identica con l'alta probabilità obbligatoria dalla spettroscopia della forza. D'altra parte, i punti del riconoscimento sulla cella 2 (Figura 3I) sono normalmente più piccoli quelli sulla cella 1 e della distanza fra i punti del riconoscimento è basicamente maggiori di quello sulla cella 1. L'area globale dei punti del riconoscimento sulla cella 2 è molto di meno che quella sulla cella 1, che correla molto bene al livello di espressione rivelatore dall'immagine della fluorescenza.

Per più ulteriormente esaminare la specificità dei punti del riconoscimento, un esperimento del blocco è stato eseguito iniettando l'anticorpo libero anti-CD4 nella soluzione di misura. Figura 4 indica che la topografia della membrana cellulare è sembrato simile dopo il blocco; tuttavia, i punti del riconoscimento sono stati diminuiti significativamente dall'anticorpo libero iniettato. Per rappresentazione prima e dopo il blocco, la stessa trave a mensola è stato utilizzato alla stesse frequenza ed ampiezza di oscillazione. La chiara riduzione dei punti del riconoscimento ha confermato la specificità dei nanodomains riconoscimento-rappresentazione-rivelatori CD4.

Figura 4. Topografia (A) e (B) le immagini del riconoscimento sulle celle fisse T24 che esprimono YFP-CD4 prima del blocco, imaged dal tipo Leva di Keysight del Mackintosh di VII functionalized con l'anticorpo anti-CD4. Circa 2,5 ore dopo l'iniezione delle molecole libere dell'anticorpo anti-CD4 (con una concentrazione definitiva di 0.05mg/ml), (C) topografia e (D) le immagini del riconoscimento sono state misurate alla stessa posizione con lo stesso suggerimento a mensola, che ha mostrato la riduzione significativa dei punti del riconoscimento. Tutte Le immagini sono state misurate ad una frequenza a mensola di 8.37kHz, un'ampiezza di oscillazione circa di 50nm e con velocità della rappresentazione circa di 2.7μm/s.

Riassunto

La combinazione completamente integrata di capacità del microscopio atomico della forza e del microscopio ottico invertito accordate dal Keysight 6000ILM AFM recentemente ha permesso ad un'indagine facile e rapida sulla distribuzione delle proteine della membrana cellulare ai disgaggi di nanometro e di micrometro. Il funzionamento semplice e conveniente di questo nuovo strumento gli renderà lo strumento preferito dei biologi e dei biofisici per le numerose applicazioni future nelle scienze biologiche al nanoscale, quindi gettando un ponte sui mondi delle ottica e della risoluzione atomica nelle circostanze fisiologiche.

Riferimenti

1. Linda Wildling, Barbara Unterauer, Rong Zhu, Anne Rupprecht, Thomas Haselgrübler, Cristiano Rankl, Andreas Ebner, Doris Vater, Philipp Pollheimer, Elena E. Pohl, Peter Hinterdorfer e Hermann J. Gruber, “Collegamento delle molecole del sensore con i gruppi amminici al AFM amminico-functionalized fornisce di punta,„ Bioconjugate Chem 22 (2011): 1239-1248.
2. Julian Weghuber, Stefan Sunzenauer, Birgit Plochberger, Mario Brameshuber, Thomas Haselgrübler e Gerhard J. Schütz, “risoluzione Temporale delle interazioni della proteina della proteina nella membrana di plasma della in tensione-cella,„ Bioanal Chem 397 Anale (2010): 3339-3347.

Circa le Tecnologie di Keysight

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Sorgente: Tecnologie di Keysight

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Date Added: May 17, 2012 | Updated: Dec 16, 2014

Last Update: 16. December 2014 12:30

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