ILM/AFM によるセルの蛍光性導かれた力の分光学及び認識イメージ投射

カバーされるトピック

導入
    生体細胞の分析の蛍光顕微鏡
    蛍光性の認識イメージ投射と AFM 方法を結合すること
実験の概要
Glycosylphosphatidylinositol (GPI) の固定された緑の蛍光蛋白質 (GFP)
黄色い蛍光蛋白質と溶ける CD4 分子 (YFP)
概要
参照
Agilent の技術について

導入

生体細胞の分析の蛍光顕微鏡

蛍光顕微鏡は生体細胞の受容器/配位子の相互作用を集中させるための重要なツールになりました。 異なった異なった分光 fluorophores が付いている蛋白質を分類することはセルの蛋白質の特定のローカリゼーションの異なった細胞、細胞レベル下かまたは分子コンポーネントそして決定のイメージ投射を可能にします。 分光にフィルタに掛けることによる不必要な、短波の背景 (刺激ライトのレイリー散乱) の拒絶は蛍光顕微鏡のとりわけ分類された細胞構造の対照を改善します。 側面および軸解像度は ~200nm の解像度のライトそして結果の回折限界によって限定されます。 最近、高リゾリューションの技術によっては、誘導放出の枯渇 (STED) のような開発されましたり、 10-30nm の (PALM)側面解像度を達成するローカリゼーションの顕微鏡検査および確率的光学復元の顕微鏡検査 (嵐) が写真作動しました。

蛍光性の認識イメージ投射と AFM 方法を結合すること

しかし光学技術はサンプル地形の情報を提供できません。 対照によって、原子力の顕微鏡検査は (AFM)地勢画像が液体の環境のナノメーターのスケールと室温で得られるようにします。 さらに、受容器/配位子のペアの認識は単一分子のレベルで調査することができます。

行われる最近開発された同時地形および認識の映像技術は Agilent の技術からの PicoTREC をここに詳しく述べられる作業のために利用して 5nm 側面の解像度で単一スキャンの同じ領域の認識部位の地勢画像、またマップをもたらすことができます。 新しい技術の運営原則はダイナミックなモード AFM イメージ投射のためのと同じです。 片持梁は共鳴頻度の近くで振動し、がサンプル表面にスキャンされます、この場合片持梁は先端に配位子を敏感に接続することによって短いリンカによって化学的になされます。 結合サイトは振動の振幅の減少から明白です。 高められた信号処理は、修正されたフィードバックループと組み合わせて、同時に地形の画像の横で得られる認識の画像を提供します。

基本的に、地勢および認識のイベントの分離はより低く、上部に片持梁の振動の振幅の分割によって達成されます (片持梁の休息位置に関して)。 これらの部品の最大値がそれから地形 (下方部分) および認識の画像 (上部) を同時に記録するのに使用されています。

この記事は蛍光性の強度の中の高い相関関係を、結合の確率および認識領域示す、また視覚化論議します Agilent 6000ILM 原子力の顕微鏡の機能を容易に対照高められた光学画像を使用して興味の領域に AFM の先端をおよび蛍光性の画像、および蛋白質の表現の異なったレベルが付いているセルで認識された nanodomains のそれに続く TREC イメージ投射および力の分光学置く。

実験の概要

生命科学および bionanotechnology の最も陰謀的なトピックの 1 つはセルおよび構成の調査および細胞膜の蛋白質の機能です。 近隣のセルへのセルシグナリング、通信連絡、および隣接したティッシュへの輸送は膜蛋白質を通して完全に組織されます。 セルシグナリングおよび細胞膜構成のための重要な蛋白質システムの 2 つの例はここに示されます。

AFM の実験は Photonicsfluorescence の顕微鏡までツァイス Axio の観測者 A1 (GPI-GFP のセルの測定のために) または a に取付けられた Agilent 6000ILM AFM を使用して行われました (YFP-CD4 のセルの測定のために)。 すべての画像は Agilent MAC のモード (すなわち、磁気 AC) を使用して室温の PBS で得られました。 Agilent のタイプ VI および VII は MAC のレバー利用され、 AFM の画像は Agilent PicoView のソフトウェアを使用して得られました。 力の分光学のための片持梁はクロロホルムで 3 回ピラニア (30% HO および 70% HSO 洗われた) で、水で22 洗浄された空気で24乾燥した 30 分の洗浄され TREC イメージ投射のための 100°C. 片持梁で熱することによって乾燥されて 3 回クロロホルムで洗浄され、空気で乾燥されました。 すべての片持梁は APTES とそして扱われましたり、 NHS-PEG- のアルデヒドか NHS 止め釘アセタールと活用し、抗体 [1] と続いてリンクしました。

Glycosylphosphatidylinositol (GPI) の固定された緑の蛍光蛋白質 (GFP)

セルの血しょう膜では、コレステロールがあり、 ` の脂質と名づけられる sphingolipid 富ませた領域は」いかだで運びます。 これらの脂質のいかだは売買するシグナリング分子のアセンブリのための組織の中心として役立ちましたり、膜の流動率および膜蛋白質に影響を及ぼしまた受容器の売買に影響を及ぼします。 例えば、効率的な受容器仲介されたシグナルの transduction のための前提条件である特定の誘発した上で、 T 細胞の受容器のような膜の受容器か B セル受容器は脂質のいかだに移動します。

Agilent 6000ILM AFM はセルの脂質のいかだの形態そして分布両方の調査を可能にしました。 これの溶けた DAF から得られた GFP に GPI のアンカー [GPI- (DAF と名づけられる) 表現するために - GFP]、非常に効果的な脂質のいかだのマーカー [2] transfected T24 セルのため (人間のぼうこうの癌腫のセル) - - ガラス底ペトリ皿で育てられました。 イメージ投射の前に、セルは 30 Min. の 4% のパラホルムアルデヒドと固定されました。

セルの地勢画像 (Figure1A) は Agilent MAC のモードを使用して得られました。 イメージ投射力は血しょう膜の下の細胞骨格のフィラメントがほとんど見ることができないほど穏やかでした。 しかしセルボーダーの Lamellipodia ははっきり検出することができます。 GPI- (DAF) のレベル - セルの GFP の表現は GFP の蛍光性の画像 (Figure1B) の取得によって検査されました。

図 1. (a) GPI-GFP (画像のサイズを表現する固定 T24 セルの AFM の地形: 50μm)。 画像は PBS の MAC のモードと 16kHz と約振動するで Agilent のタイプ VI MAC のレバーを 15μm/s. のイメージ投射速度の 7nm 使用することによって測定されました。 イメージ投射力は血しょう膜の下の細胞骨格のフィラメントがほとんど見ることができないほど穏やかでした。 しかしセルボーダーの Lamellipodia ははっきり検出することができます。 (b) GPI-GFP の表現のレベルを示す同じセルの蛍光性の画像 (FITC フィルターセット、 100 つの x の拡大)。 核の近くのある明るい領域は GPI 固定された蛋白質が (ER)総合される小胞体を明記します。 ER 領域を越えて、血しょう膜の GPI-GFP の分布は複数の明るい点 (赤の広場の例えば、それら) を除いて同質に、見ます。 (c) 反GFP 抗体と functionalized (b) で片持梁を赤の広場とマークされた領域の認識の画像は使用することによって 200-300nm の約サイズの nanodomains を明らかにしました。 蛍光性の画像で示されている microdomain によく関連するダッシュで結ばれる青い円とマークされる領域では nanodomains は集約されました。 認識イメージ投射の間に、片持梁は 16 の kHz と 6.5μm/s. 画像のサイズのイメージ投射速度の 7nm で約振動していました: 5μm。

セルの核の近くで GPI 固定された蛋白質はセルの核を囲む小胞体で総合されるという事実に従ってである非常に高い蛍光性の (ER)強度のある領域があります、 (図 2) を見て下さい。 ER 領域を越えて、地勢高さと cytosol のよりもむしろ血しょう膜にことを GPI- (DAF) のほとんど - GFP の分子あります提案する蛍光性の強度間に相関関係がありません。 時折、ある明るい蛍光性の点は赤の広場 (Figure1B) とマークされるように ER 領域から遠くに、見つけることができます。 そのような明るい点は cytosol の小胞または血しょう膜の microdomain であるかもしれません。 一般に、最も高い拡大 (100x) を用いる慣習的な蛍光顕微鏡は GPI- (DAF) の同質な分布を - 血しょう膜の GFP 示します。

セルの図 2. 認識の測定のための結合された光学および原子力の顕微鏡検査の図式的な図表。 GPI 固定された GFP は ER で総合され、 Golgi で修正され、そして血しょう膜への小胞で運ばれます。 光学顕微鏡が蛍光性の測定によって GPI-GFP の全面的な表現のレベルおよびマイクロメートルスケールの分布を検査できる間、抗体functionalized の片持梁による認識イメージ投射はナノメーターのスケールで GPI-GFP の分布を視覚化できます。 認識イメージ投射のために、片持梁は一定した振幅で振動します。 先端の抗体がセル表面の GFP と結合するとき、振動の波の上部は減ります。 これは振動の波が上部および下方部分に分割される Agilent PicoTREC ボックスによって検出することができます。 振動の波の上部が認識の画像を組み立てるのに使用されています。 ここでは、認識のイベントは赤で示されています。

GPI- (DAF) の分布を - ナノメーターのレベルの GFP 調査するためには、 TREC イメージ投射は利用されました。 反GFP 抗体と functionalized 図 2. で片持梁先端を使用して TREC イメージ投射の原則は示されています。 イメージ投射の間に、片持梁は (磁界によって運転されて) 振動します一定した振幅で。 先端の抗体がセル表面の GFP と結合するとき、振動の上部は減ります。 これは振動の波が上部および下方部分に分割される Agilent PicoTREC ボックスによって検出することができます。 振動の波の上部から、認識の画像は組み立てることができます; 結合のイベントの領域は黒ずみとして示されています。

Figure1B の赤の広場とマークされる図 1C で領域の認識の画像は示されています。 認識の画像から、それはこと GPI- (DAF) - GFP の分子形作ります 200-300nm の約サイズの nanodomains を見ることができます。 蛍光性の画像の microdomain のように見えるダッシュで結ばれる青い円とマークされる領域では nanodomains は集約されました。 そのような microdomain は蛍光性と認識の画像間の相関関係を示すために一義的な橋を提供します。

黄色い蛍光蛋白質と溶ける CD4 分子 (YFP)

CD4 (微分 4) のクラスタ、最初に T のヘルパー細胞の表面で見つけられる糖蛋白質演劇免疫学に於いての非常に重要な役割および HIV の病気。 CD4 蛋白質の分布は YFP 溶かされた CD4 を表現するために transfected T24 セルで調査されました。 そのようなセルは蛍光顕微鏡および AFM の使用によって固定そして視覚化されていました。 brightfield の画像および蛍光性の画像 (図 3A および 3B) から、それはことがセルのいくつか分られました (図 3) の例えば、セル 1 に YFP-CD4 の高い表現が、が他のあるセルあります (図 3) の例えば、セル 2 に非常に低い表現があります。

図 3. (a) Brightfield の画像および (b) 固定 T24 セルの蛍光性の画像は YFP-CD4 と明らかにしますことをセルのいくつか transfected (例えば、セル 1) に YFP-CD4 の高い表現が、が他のあるセルあります (例えば、セル 2) に非常に低い表現があります。 光学画像の指導によって、力の分光学および認識イメージ投射はセル 1 およびセル 2. で行われました。 セル 1 で、 90.2% の結合の確率に終る 220 のカーブショーの結合のイベント、 244 の力間隔のカーブは測定されました。 (F-I) セル 1 および Agilent のタイプ VII MAC のレバーが付いているセル 2 で測定された AFM の地形および認識の画像は反CD4 抗体と functionalized。 2 つのセルの画像は同じ頻度 (8kHz) および 1.9μm/s. セルの約イメージ投射速度の振幅の同じ先端と (50nm について) 1 測定されました (パネル H) は 100 から 200nm まで及ぶサイズの多くの大きい認識の点をがセル 2 示しました (パネル I) はより遠い間隔の大いにより小さい点を示しました。

光学画像の指導によって、力の分光学および認識イメージ投射はセル 1 および 2. で行われました。 これらの測定のために、片持梁先端は反CD4 抗体と functionalized。 セル 1 で、 90.2% の結合の確率に終る 220 のカーブショーの結合のイベント、 244 の力間隔のカーブは測定されました (図 3D)。 結合のイベントの典型的な力間隔のカーブは図 3C で示されています。 セル 2 で、 4.1% の結合の確率に終る 10 のカーブショーの結合のイベントだけ、 241 の力の間隔のカーブは測定されました。 結合のイベントのない典型的な力間隔のカーブは図 3E で示されています。 2 つのセルの力間隔のカーブの測定は同じ先端と行われました。 cells1 および 2 のための結合の確率は蛍光性の強度の非常に十分な一致にあります。

これら二つのセルのセル 1 および 2. 画像の 3I ショーへの図 3F は測定された AFM の地形および認識の画像同じ頻度および振幅の同じ先端と測定されました。 100 から 200nm まで及ぶサイズのセル 1 (図 3H) に多くの大きい認識の点があることが分られました。 認識の点のほとんどは地形の穴領域にあります、認識の点はまた地形 (図 3F) の突出領域で見つけることができます。

nanodomains の多数は既に互いに接続されます。 認識の点のそのような高密度はセル 1 の強い蛍光性のシグナルと一致し、力の分光学からの高い結合の確率と同一です。 一方では、セル 2 (図 3I) の認識の点は普通セル 1 のそれら、および認識の点間の間隔より小さいですセル 1. のそれより基本的に大きいです。 セル 2 の認識の点の全面的な領域は大いに蛍光性の画像によって明らかにされる表現のレベルにとてもよく関連するセル 1 のそれよりより少しです。

更に認識の点の特定性を検査するために、ブロックの実験は測定の解決に自由な反CD4 抗体を注入することによって行われました。 細胞膜の地形がブロックの後で類似している見たことを図 4 は示します; ただし、認識の点は注入された自由な抗体によってかなり減りました。 イメージ投射のためブロックが同じ振動の頻度および振幅で、同じ片持梁使用された前後に。 認識の点の明確な減少は認識イメージ投射明らかにされた CD4 nanodomains の特定性を確認しました。

Agilent のタイプ VII Mac のレバーによって反CD4 抗体と視覚化されたブロックの前に YFP-CD4 を表現する固定 T24 セルの図 4. (a) 地形および (b) 認識の画像は functionalized。 自由な反CD4 抗体の分子 (0.05mg/ml の最終的な集中と)、 (c) 地形および (d) 認識の画像の注入の後の約 2.5 時間は認識の点の重要な減少を示した同じ片持梁先端の同じ位置で測定されました。 すべての画像は 8.37kHz の片持梁振動の頻度、 50nm の、そして 2.7μm/s. の約イメージ投射速度の振幅で約測定されました。

概要

Agilent 6000ILM AFM によるマイクロメートルおよびナノメーターのスケールで原子力の顕微鏡および逆にされた光学顕微鏡の機能の十分に統合された組合せは最近細胞膜蛋白質の分布の容易で、速い調査を可能にしました。 この新しい器械の簡単で、便利な操作は nanoscale で生物学者および biophysicists のそれに生命科学の多数の未来のアプリケーションのための最適なツールをしま、生理学的な条件の下でそれにより光学および原子解像度の世界を繋ぎます。

参照

1. リンダ Wildling、バーバラ Unterauer、 Rong 朱、アン Rupprecht、トマス Haselgrübler のクリスチャン Rankl、アンドレアス Ebner、 Doris Vater、 Philipp Pollheimer、エレナ E. Pohl、ピーター Hinterdorfer、および Hermann J. Gruber は、 「アミノfunctionalized AFM へのアミノグループとセンサーの分子のリンク」、 Bioconjugate Chem 22 (2011 年) ひっくり返ます: 1239-1248。
2. ジュリアンの Weghuber、ステファン Sunzenauer、ビルギット Plochberger、マリオ Brameshuber、トマス Haselgrübler、およびゲルハルト J. Schutzz、 「生きていセル血しょう膜の蛋白質蛋白質の相互作用の一時的な解像度」、肛門の Bioanal Chem 397 (2010 年): 3339-3347。

Agilent の技術について

ナノテクノロジーの器械は画像可能にし、処理し、そして電気、化学、生物的、分子、および原子いろいろ nanoscale の動作を - 特徴付けます。 ナノテクノロジーの器械、アクセサリ、ソフトウェア、サービスおよび消耗品の私達の成長するコレクションはあなたが nanoscale の世界を理解する必要がある糸口を明らかにすることができます。

Agilent の技術は一義的な研究の必要性を満たすために高精度の原子力の顕微鏡 (AFM)の広い範囲を提供します。 Agilent の非常に設定可能な器械は必要性が発生すると同時にシステム・ケイパビリティを拡大することを可能にします。 Agilent の工業一流の環境の温度システムおよび流動処理は優秀な液体および柔らかい材料イメージ投射を可能にします。 アプリケーションは物質科学、電気化学、ポリマーおよび人生の科学アプリケーションを含んでいます。

Date Added: May 17, 2012 | Updated: Jul 15, 2013

Last Update: 15. July 2013 16:10

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