ILM/AFM를 통해 세포에 형광 인도된 군대 분광학 & 승인 화상 진찰

커버되는 토픽

소개
    생세포 분석에 있는 형광 현미경 검사법
    형광 승인 화상 진찰과 AFM 방법 결합
실험의 개관
Glycosylphosphatidylinositol (GPI) 정박된 녹색 형광성 단백질 (GFP)
노란 형광성 단백질로 융합되는 CD4 분자 (YFP)
개요
참고
Agilent 기술에 관하여

소개

생세포 분석에 있는 형광 현미경 검사법

형광 현미경 검사법은 생세포에 있는 수용체/ligand 상호 작용 지방화를 위한 중요한 공구가 되었습니다. 다른 괴기한 fluorophores 여러가지 단백질을 레테르를 붙이는 것은 세포에 있는 단백질의 특정 지방화의 다른 셀 방식, subcellular, 또는 분자 분대 그리고 결심의 화상 진찰을 허용합니다. 괴기한 필터에 의하여 쓸모 없는, 단파장 배경 (흥분 빛의 Rayleigh 뿌리기)의 거절은 형광 현미경 검사법에 있는 특히 레테르를 붙인 셀 방식 구조물의 대조를 향상합니다. 옆과 축 해결책은 ~200nm 해결책에 있는 빛 그리고 결과의 회절 한계에 의해 제한됩니다. 최근에, 고해상을 가진 기술은 자극 방출 소모 (STED)와 같이 개발되고 10-30nm의 (PALM) 옆 해결책을 달성하는 지방화 현미경 검사법 및 확률론적인 광학적인 개조 현미경 검사법 (폭풍우)를 사진 활성화했습니다.

형광 승인 화상 진찰과 AFM 방법 결합

광학적인 기술은, 그러나, 견본 지세의 어떤 정보든지 제공할 수 없습니다. 대조적으로, 원자 군대 현미경 검사법은 (AFM) 지형도 작성 심상이 액체 환경에 있는 나노미터 가늠자와 실내 온도에 장악되는 것을 허용합니다. 추가적으로, 수용체/ligand 쌍의 승인은 단 하나 분자 수준에 조사될 수 있습니다.

능력을 발휘한 최근에 개발한 동시 지세와 승인 화상 기술은 Agilent 기술에서 PicoTREC를 여기에 선발된 일을 위해 이용해서, 5nm 옆쪽 해결책에 단 하나 검사를 가진 동일 지역의 인식 부위의 지형도 작성 심상 뿐 아니라 지도 열매를 산출 가능합니다. 새로운 기술의 운영 법칙은 동적인 최빈값 AFM 화상 진찰을 위해와 동일입니다. 외팔보는 그것의 공명 주파수의 가까이에 전류를 고주파로 변환시키고 견본 표면에 검사됩니다, 그러나 이 경우에는 외팔보는 그것의 끝에 ligand를 과민한 붙여서 짧은 링커를 통해 화학적으로 합니다. 의무 사이트는 진동 진폭의 감소에서 분명합니다. 강화한 신호 처리는, 변경한 되먹임 루프와 조화하여, 동시에 지세 심상 나란히 취득된 승인 심상을 제공합니다.

필수적으로, 지형도 작성과 승인 사건의 별거는 더 낮은 상부로 외팔보의 진동 진폭을 나누어서 달성됩니다 (외팔보의 휴식 위치에 관하여). 이 부속의 최대는 그 때 지세 (하부) 및 승인 심상 (상부)를 동시에 기록하기 위하여 이용됩니다.

이 약품은 쉽게 대조 강화한 광학적인 심상을 사용하여 관심사의 지구에 AFM 끝을 및 형광 심상, 및 단백질 표정의 수준 여러가지 세포에 인식한 nanodomains의 연속적인 TREC 화상 진찰과 군대 분광학 뿐 아니라 구상 두는 형광 강렬의 사이에서 높은 상호 관계를, 의무적인 확율 및 승인 지역 보여주는, Agilent 6000ILM 원자 군대 현미경의 기능을 토론합니다.

실험의 개관

생명 공학과 bionanotechnology에 있는 음모를 꾸미는 토픽의 한개는 세포와 편성부대의 수사 및 세포막에 있는 단백질의 기능입니다. 이웃 세포에 세포 신호, 커뮤니케이션, 및 인접한 조직에 수송은 막 단백질을 통해서 전부 편성됩니다. 세포 신호와 세포막 편성부대를 위한 중요한 단백질 시스템의 2개의 보기는 여기에서 제출됩니다.

AFM 실험은 Photonicsfluorescence 현미경까지 Zeiss Axio 관찰자 A1 (GPI-GFP를 가진 세포의 측정을 위해) 또는 a에 거치된 Agilent 6000ILM AFM를 사용하여 능력을 발휘했습니다 (YFP-CD4를 가진 세포의 측정을 위해). 모든 심상은 Agilent MAC 최빈값 (i.e, 자석 AC)를 사용하여 실내 온도에 PBS에서 취득되었습니다. Agilent 모형 VI와 VII는 MAC 레버 이용되고 AFM 심상은 Agilent PicoView 소프트웨어를 사용하여 취득되었습니다. 군대 분광학을 위한 외팔보는 클로로프롬에서 3 시간 피라니아 (30% HO와 근해로 헹궈진 70% HSO)에서22 세척된 공기에서24 말려진 30 분 동안 세척되고, TREC 화상 진찰을 위한 100°C. 외팔보에 가열해서 말리 3 시간 클로로프롬에서 세척되고 공기에서 말려짔습니다. 모든 외팔보는 APTES로 그 후에 취급되고, NHS-PEG- 알데하이드 또는 NHS 나무못 아세탈로 활용시키고, 항체 [1과] 연속적으로 연결했습니다.

Glycosylphosphatidylinositol (GPI) 정박된 녹색 형광성 단백질 (GFP)

세포의 원형질막에서는, 콜레스테롤이 있고 ` 지질이라고 불린 sphingolipid 풍성하게 한 도메인은' 뗏목으로 나릅니다. 이 지질 뗏목은 매매하는 신호 분자의 집합 위한 편성 센터 역할을 하, 막 유동성과 막 단백질을 좌우하고, 또한 수용체 매매를 좌우합니다. 예를 들면, 능률적인 수용체 중재한 신호 변환을 위한 전제조건인 특정 시작에, T 세포 수용체와 같은 막 수용체 또는 B 세포 수용체는 지질 뗏목으로 장소를 옭깁니다.

Agilent 6000ILM AFM는 세포에 지질 뗏목의 형태학 그리고 배급 둘 다의 수사를 허용했습니다. 이것 의 융합된 DAF에서 파생된 GPI-이라고 (DAF 불리는) GFP에 GPI 닻 [표현하기 위하여 - GFP], 매우 효과적인 지질 뗏목 마커 [2] transfected T24 세포를 위해 (인간적인 방광 암 세포) - - 유리 바닥 세균 배양용 접시에 증가되었습니다. 화상 진찰의 앞에, 세포는 30 Min. 동안 4% paraformaldehyde로 고쳐졌습니다.

세포의 지형도 작성 심상 (Figure1A)는 Agilent MAC 최빈값을 사용하여 장악되었습니다. 화상 진찰 군대는 원형질막 밑에 세포 뼈대의 필라멘트가 단단하게 보일 수 있지 않다 때문에 이렇게 온화했습니다. 세포 국경에 Lamellipodia는, 그러나, 명확하게 검출될 수 있습니다. GPI- (DAF)의 수준 - 세포에 있는 GFP 표정은 GFP 형광 심상 (Figure1B)를 장악해서 검토되었습니다.

숫자 1. (a) GPI-GFP (심상 규모를 표현하는 조정 T24 세포의 AFM 지세: 50μm). 심상은 PBS에 있는 MAC 최빈값으로 16kHz와 대략 전류를 고주파로 변환시키는에 Agilent 모형 VI MAC 레버를 15μm/s.의 화상 진찰 속도를 가진 7nm 사용해서 측정되었습니다. 화상 진찰 군대는 원형질막 밑에 세포 뼈대의 필라멘트가 단단하게 보일 수 있지 않다 때문에 이렇게 온화했습니다. 세포 국경에 Lamellipodia는, 그러나, 명확하게 검출될 수 있습니다. (b) GPI-GFP의 표정 수준을 보여주는 동일 세포의 형광 심상 (FITC 필터 세트, 100개의 x 확대). 몇몇 밝은 지구는 핵에 표시합니다 GPI 정박된 단백질이 (ER) 종합되는 소포체를 가깝습니다. ER 지구 저쪽에, 원형질막에 있는 GPI-GFP의 배급은 몇몇 밝은 점 (붉은 광장에서 예를들면, 그들)를 제외하면 균질에, 봅니다. (c) 반대로 GFP 항체로 functionalized (b)에 있는 외팔보를, 붉은 광장으로 표를 한 지구의 승인 심상은 사용해서 200-300nm의 대략 규모를 가진 nanodomains를 제시했습니다. 형광 심상에서 보인 microdomain에 잘 상관하는 지독한 파란 원형으로 표를 한 지구에서는, nanodomains는 모였습니다. 승인 화상 진찰 도중, 외팔보는 16 kHz와 6.5μm/s. 심상 규모의 화상 진찰 속도를 가진 7nm에 대략 전류를 고주파로 변환시키고 있었습니다: 5μm.

거기 세포의 핵에입니다 GPI 정박된 단백질은 세포의 핵을 포위하는 소포체에서 종합되다 는 사실에 따라 인 아주 높은 형광 (ER) 강렬을 가진 몇몇 지구 가깝, (숫자 2)를 보십시오. ER 지구 저쪽에, 지형도 작성 고도와 cytosol에서 보다는 오히려 원형질막에서 GPI- (DAF)의 대부분 - GFP 분자 있습니다 건의하는 형광 강렬 사이 아무 상호 관계도 없습니다. 때때로, 몇몇 밝은 형광 점은 붉은 광장 (Figure1B)로 표를 하는 것과 같이 ER 지구에서 아주 저쪽에 찾아낼 수 있습니다. 그 같은 밝은 점은 cytosol에 있는 소포 또는 원형질막에 있는 microdomain일지도 모릅니다. 일반적으로 가장 높은 확대 (100x)를 가진 전통적인 형광 현미경 검사법은 GPI- (DAF)의 균질 배급을 - 원형질막에 있는 GFP 보여줍니다.

세포에 숫자 2. 승인 측정을 위한 결합된 광학 및 원자 군대 현미경 검사법의 개요 도표. GPI 정박된 GFP는 ER에서 종합되고, Golgi에서 변경되고, 원형질막에 소포를 통해 수송됩니다. 광학적인 현미경이 형광 측정을 통해 GPI-GFP의 전반적인 표정 수준과 마이크로미터 가늠자 배급을 검토하는 수 있는 동안, 항체 functionalized 외팔보에 의하여 승인 화상 진찰은 나노미터 가늠자에 GPI-GFP의 배급을 구상할 수 있습니다. 승인 화상 진찰을 위해, 외팔보는 일정한 진폭에 전류를 고주파로 변환시킵니다. 끝에 항체가 세포 표면에 GFP로 묶을 때, 진동 파의 상부는 감소됩니다. 이것은 진동 파가 위와 하부로 나뉘는 Agilent PicoTREC 상자에 의해 검출될 수 있습니다. 진동 파의 상부는 승인 심상을 구성하기 위하여 이용됩니다. 여기에서, 승인 사건은 공산분자에서 보입니다.

GPI- (DAF)의 배급을 - 나노미터 수준에 GFP 조사하기 위하여는, TREC 화상 진찰은 이용되었습니다. 반대로 GFP 항체로 functionalized 숫자 2.에서 공가 끝을 사용하여 TREC 화상 진찰의 원리는 보입니다. 화상 진찰 도중, 외팔보는 (자기장에 의해 몰아) 전류를 고주파로 변환시킵니다 일정한 진폭에. 끝에 항체가 세포 표면에 GFP로 묶을 때, 진동의 상부는 감소됩니다. 이것은 진동 파가 위와 하부로 나뉘는 Agilent PicoTREC 상자에 의해 검출될 수 있습니다. 진동 파의 상부에서, 승인 심상은 구성될 수 있습니다; 의무적인 사건을 가진 지역은 짙은 반점으로 보입니다.

Figure1B에 있는 붉은 광장으로 표를 한 숫자 1C에서 지구의 승인 심상은 보입니다. 승인 심상에서, GPI- (DAF) - GFP 분자 형성합니다 200-300nm의 대략 규모를 가진 nanodomains를 보일 수 있습니다. 형광 심상에 있는 microdomain와 같이 보이는 지독한 파란 원형으로 표를 한 지구에서는, nanodomains는 모였습니다. 그런 microdomain는 유일한 형광과 승인 심상 사이 상호 관계를 보여주기 위하여 브리지를 제공합니다.

노란 형광성 단백질로 융합되는 CD4 분자 (YFP)

CD4 (감별법 4)의 다발, 원래 T 도움 세포의 표면에 찾아내는 당단백, 실행 면역학에 있는 아주 중요한 역할 및 HIV의 질병. CD4 단백질의 배급은 YFP 융합된 CD4를 표현하기 위하여 transfected T24 세포에 조사되었습니다. 그 같은 세포는 형광 현미경 검사법과 AFM를 사용해서 조정 그리고 imaged 이었습니다. brightfield 심상 및 형광 심상 (숫자 3A와 3B)에서, 것을 몇몇의 세포 발견되었습니다 (숫자 3)에서 예를들면, 세포 1에은 YFP-CD4의 높은 표정이, 그러나 다른 어떤 세포 있습니다 (숫자 3)에서 예를들면, 세포 2에는 아주 낮은 표정이 있습니다.

숫자 3. (a) Brightfield 심상과 (b) 조정 T24 세포의 형광 심상은 YFP-CD4로 제시합니다 몇몇의 세포 transfected (예를들면, 세포 1)에는 YFP-CD4의 높은 표정이, 그러나 다른 어떤 세포 있습니다 (예를들면, 세포 2)에는 아주 낮은 표정이 있습니다. 광학적인 심상의 지도로, 군대 분광학과 승인 화상 진찰은 세포 1과 세포 2.에 능력을 발휘했습니다. 세포 1에, 90.2%의 의무적인 확율의 결과로 220의 곡선 쇼 의무적인 사건, 244 군대 거리 곡선은 측정되었습니다. (F-I) 세포 1과 Agilent 모형 VII MAC 레버를 가진 세포 2에 측정된 AFM 지세와 승인 심상은 반대로 CD4 항체로 functionalized. 2개의 세포에 심상은 동일 주파수 (8kHz) 및 1.9μm/s. 세포의 대략 화상 진찰 속도를 가진 진폭에 동일 끝으로 (50nm에 관하여) 1 측정되었습니다 (위원회 H)는 100에서 200nm에 구역 수색하는 규모를 가진 많은 큰 승인 반점을, 그러나 세포 2 보여주었습니다 (위원회 I)는 더 먼 거리를 가진 매우 더 작은 반점을 보여주었습니다.

광학적인 심상의 지도로, 군대 분광학과 승인 화상 진찰은 세포 1과 2.에 능력을 발휘했습니다. 이 측정을 위해, 공가 끝은 반대로 CD4 항체로 functionalized. 세포 1에, 90.2%의 의무적인 확율의 결과로 220의 곡선 쇼 의무적인 사건, 244 군대 거리 곡선은 측정되었습니다 (숫자 3D). 의무적인 사건을 가진 전형적인 군대 거리 곡선은 숫자 3C에서 보입니다. 세포 2에, 4.1%의 의무적인 확율의 결과로 단지 10의 곡선 쇼 의무적인 사건만, 241의 군대 거리 곡선은 측정되었습니다. 의무적인 사건 없는 전형적인 군대 거리 곡선은 숫자 3E에서 보입니다. 2개의 세포에 군대 거리 곡선 측정은 동일 끝으로 실행되었습니다. cells1와 2를 위한 의무적인 확율은 형광 강렬을 가진 아주 유리한 계약에 있습니다.

이러한 두 종류 세포에 세포 1과 2. 심상에 3I 쇼에 숫자 3F는 측정된 AFM 지세와 승인 심상 동일 주파수 및 진폭에 동일 끝으로 측정되었습니다. 100에서 200nm에 구역 수색한다는 것은 규모를 가진 세포 1 (숫자 3H)에 많다는 것은 크다는 것은 승인 반점이 있다는 것은 것을 발견되었습니다. 승인 반점의 대부분은 지세에 있는 구멍 지구에서 있습니다, 그러나 승인 반점은 또한 지세 (숫자 3F)에 있는 돌기 지구에서 찾아낼 수 있습니다.

nanodomains의 많은 것은 서로 이미 연결됩니다. 승인 반점의 그런 고밀도는 세포 1에 강한 형광 신호로 투합하고, 군대 분광학에서 높은 의무적인 확율에 동일합니다. 다른 한편으로는, 세포 2 (숫자 3I)에 승인 반점은 일반적으로 세포 1에 그들, 그리고 승인 반점 사이 거리 보다는 더 작습니다 세포 1.에 그것 보다는 기본적으로 더 중대합니다. 세포 2에 승인 반점의 전반적인 지역은 매우 형광 심상에 의해 제시된 표정 수준에 아주 잘 상관하는 세포 1에 그것 보다는 더 적은입니다.

더 멀리 승인 반점의 특이성을 검토하기 위하여, 구획 실험은 측정 해결책으로 자유로운 반대로 CD4 항체를 주사해서 능력을 발휘했습니다. 세포막의 지세가 구획 후에 유사하게 봤다는 것을 숫자 4는 보여줍니다; 그러나, 승인 반점은 주사한 자유로운 항체에 의해 현저하게 감소되었습니다. 화상 진찰을 위해 구획이 동일 진동 주파수 및 진폭에, 동일 외팔보 이용되기 전후에. 승인 반점의 명확한 감소는 승인 화상 진찰 제시한 CD4 nanodomains의 특이성을 확인했습니다.

Agilent 모형 VII Mac 레버에 의하여 반대로 CD4 항체로 imaged 구획의 앞에 YFP-CD4를 표현하는 조정 T24 세포에 숫자 4. (a) 지세와 (b) 승인 심상은 functionalized. 자유로운 반대로 CD4 항체 분자 (0.05mg/ml의 마지막 사격량에), (c) 지세 및 (d) 승인 심상의 주입 후에 대략 2.5 시간은 승인 반점의 중요한 감소를 보여준 동일 공가 끝을 가진 동일 위치에 측정되었습니다. 모든 심상은 8.37kHz의 공가 진동 주파수, 50nm의, 그리고 2.7μm/s.의 대략 화상 진찰 속도를 가진 진폭에 대략 측정되었습니다.

개요

Agilent 6000ILM AFM에 의한 마이크로미터와 나노미터 가늠자에 원자 군대 현미경 및 거꾸로 한 가벼운 현미경 기능의 완전히 통합 조합은 최근에 세포막 단백질의 배급의 쉽고 빠른 수사를 가능하게 했습니다. 이 새로운 계기의 간단하고 편리한 작동은 nanoscale에 생물학자와 생물 물리학자의 그것에게 생명 공학에 있는 수많은 미래 응용을 위한 선호한 공구를 만들어, 생리적인 조건 하에서 그로 인하여 광학과 원자 해결책의 세계를 다리를 놓.

참고

1. Linda Wildling, 바바라 Unterauer, Rong 주, Anne Rupprecht, 토마스 Haselgrübler 의 기독교인 Rankl, Andreas Ebner, Doris Vater, Philipp Pollheimer, Elena E. Pohl, 피터 Hinterdorfer, 및 Hermann J. Gruber는, "아미노 functionalized AFM에 아미노기와 센서 분자의 연결," Bioconjugate Chem 22 (2011년) 기울입니다: 1239-1248년.
2. 율리우스 Weghuber, Stefan Sunzenauer, Birgit Plochberger, 마리오 Brameshuber, 토마스 Haselgrübler, 및 Gerhard J. Schutzz, "살아있 세포 원형질막에 있는 단백질 단백질 상호 작용의 시간 해상도," 항문 Bioanal Chem 397 (2010년): 3339-3347.

Agilent 기술에 관하여

나노 과학 계기에 의하여 심상 시키고, 조작하고, 전기, 화학, 생물학, 분자, 그리고 원자 다양한 nanoscale 행동이 - 성격을 나타냅니다. 나노 과학 계기, 부속품, 소프트웨어, 서비스 및 소모품의 우리의 성장하고 있는 수집은 당신이 nanoscale 세계를 이해할 필요가 있는 실마리를 제시할 수 있습니다.

Agilent 기술은 높 정밀도 원자 군대 현미경의 유일한 (AFM) 연구 필요를 충족시키기 위하여 광범위를 제안합니다. Agilent의 높게 설정 가능한 계기는 필요가 생기는 때 시스템 기능을 확장하는 것을 허용합니다. Agilent의 산업 주요한 환경 온도 시스템 및 유동성 취급은 우량한 액체 및 연약한 물자 화상 진찰을 가능하게 합니다. 응용은 재료 과학, 전기화학, 중합체 및 생활 과학 응용을 포함합니다.

Date Added: May 17, 2012 | Updated: Jul 15, 2013

Last Update: 15. July 2013 16:13

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