De de fluorescentie-geleide Spectroscopie van de Kracht & Weergave van de Erkenning op Cellen via ILM/AFM

Gesponsord door Keysight Technologies

Besproken Onderwerpen

Inleiding
    De Microscopie van de Fluorescentie in het Leven de Analyse van de Cel
    Het Combineren van methodes AFM met de Weergave van de Erkenning van de Fluorescentie
Overzicht van Experimenten
Glycosylphosphatidylinositol (GPI) Verankerde Groene Fluorescente Proteïne (GFP)
CD4 Molecules die met Gele Fluorescente Proteïne worden Gesmolten (YFP)
Samenvatting
Verwijzingen
Ongeveer Technologieën Keysight

Inleiding

De Microscopie van de Fluorescentie in het Leven de Analyse van de Cel

De microscopie van de Fluorescentie is een belangrijk hulpmiddel geworden om receptor/ligand interactie in levende cellen te lokaliseren. De Etikettering van verschillende proteïnen met verschillende spectrale fluorophores staat weergave van verschillende cellulaire, subcellular, of moleculaire componenten en bepaling van de specifieke localisatie van de proteïnen in cellen toe. De verwerping van ongewenste, short-wavelength achtergrond (het verspreiden Rayleigh zich van opwindingslicht) door spectrale te filtreren verbetert het contrast van specifiek geëtiketteerde cellulaire structuren in de fluorescentiemicroscopie. De zij en asresoluties worden beperkt door de diffractiegrens van licht en resultaat in ~200nm- resolutie. Onlangs, zijn de technieken met hogere resolutie ontwikkeld, zoals bevorderde emissieuitputting (STED), de foto-geactiveerde localisatiemicroscopie (PALM), en de stochastische optische wederopbouwmicroscopie (ONWEER), die zijresolutie van 1030nm bereiken.

Het Combineren van methodes AFM met de Weergave van de Erkenning van de Fluorescentie

De Optische technieken, echter, kunnen geen informatie van de steekproeftopografie verstrekken. Door contrast, laat de atoomkracht (AFM)microscopie topografische beelden toe om bij de nanometerschaal in vloeibare milieu's en bij kamertemperatuur worden verkregen. Bovendien kan de erkenning van receptor/ligand paren op het enig-moleculeniveau worden onderzocht.

Een onlangs ontwikkelde gelijktijdige topografie en van de erkenningsweergave techniek, voerde het gebruiken van PicoTREC van Technologieën Keysight voor het hierin gedetailleerde werk uit, kan een topografisch beeld evenals een kaart van erkenningsplaatsen van het zelfde gebied met één enkel aftasten bij 5nm zijresolutie opbrengen. Het werkende principe van de nieuwe techniek is het zelfde als voor dynamische wijzeAFM weergave. Een cantilever wordt geoscilleerd dichtbij zijn resonantiefrequentie en over de steekproefoppervlakte afgetast, maar in dit geval wordt de cantilever gemaakt chemisch gevoelig door een ligand via korte linker aan zijn uiteinde vast te maken. De bandplaatsen zijn duidelijk van de vermindering van schommelingsomvang. De Verbeterde signaalverwerking, in combinatie met gewijzigd koppelt lijn terug, verstrekt een erkenningsbeeld dat gelijktijdig naast een topografiebeeld wordt verworven.

Hoofdzakelijk, wordt de scheiding van topografische en erkenningsgebeurtenissen bereikt door de de schommelingsomvang van de cantilever in lagere en hogere delen (met betrekking tot de rustende positie van de cantilever) te verdelen. De maxima deze delen worden dan gebruikt om de topografie (lagere delen) en erkenningsbeeld (hogere delen) tezelfdertijd te registreren.

Dit artikel bespreekt de capaciteit van de atoom de krachtmicroscoop van Keysight 6000ILM om het uiteinde AFM aan gebieden van belang gemakkelijk te plaatsen gebruikend een contrast-verbeterd optisch beeld en een fluorescentiebeeld, en de verdere weergave TREC en de krachtspectroscopie, die hoge correlatie onder fluorescentieintensiteit, bindende waarschijnlijkheid, en erkenningsgebied, evenals de visualisatie van erkend nanodomains op cellen met verschillende niveaus van eiwituitdrukking tonen.

Overzicht van Experimenten

Één van de meest intrigerende onderwerpen in het levenswetenschap en bionanotechnology is het onderzoek van cellen en de organisatie en de functie van proteïnen in het celmembraan. Het signaleren van de Cel, de mededeling aan naburige cellen, en het vervoer aan aangrenzend weefsel worden allen georganiseerd door membraanproteïnen. Twee voorbeelden van belangrijke eiwitsystemen voor cel het signaleren en de organisatie van het celmembraan worden hier voorgelegd.

De experimenten AFM werden uitgevoerd gebruikend een Keysight 6000ILM AFM opgezet op een Waarnemer A1 van Zeiss Axio (voor meting van cellen met gpi-GFP) of TOT microscoop Photonicsfluorescence (voor meting van cellen met yfp-CD4). Alle beelden werden verworven in PBS bij kamertemperatuur gebruikend de Wijze van MAC Keysight (d.w.z., magnetische AC). Type VI en VII van Keysight de Hefbomen van MAC werden gebruikt en de beelden AFM werden verworven gebruikend de software van Keysight PicoView. De Cantilevers voor de krachtspectroscopie werden gewassen in chloroform drie keer, droog in lucht, die in piranha (30% HO en 70%22 HSO) wordt gewassen2 voor4 30 min, die met water worden gespoeld, en droog door te verwarmen bij Cantilevers 100°C. voor weergave TREC werden gewassen in chloroform drie keer en droog in lucht. Alle cantilevers werden toen behandeld met APTES, vervoegden met NHS-PIN aldehyde of NHS-pin-Acetal, en verbonden later met antilichaam [1].

Glycosylphosphatidylinositol (GPI) Verankerde Groene Fluorescente Proteïne (GFP)

In het plasmamembraan van cellen, zijn er cholesterol en sphingolipid-verrijkte domeinen, genoemd ` lipidevlotten'. Deze lipidevlotten dienen als het organiseren van centra voor de assemblage van signalerende molecules, beïnvloeden membraanvloeibaarheid en membraan het eiwit handel drijven, en ook invloedsreceptor het handel drijven. Bijvoorbeeld, op het specifieke teweegbrengen, plaatsen de membraanreceptoren zoals T-cell receptoren of de B-Cel receptoren in lipidevlotten over, wat de eerste vereiste voor efficiënte receptor-bemiddelde signaaltransductie is.

Keysight 6000ILM AFM stond het onderzoek van zowel de morfologie als de distributie van lipidevlotten op toe cellen. Voor dit, T24 de cellen (de menselijke cellen van het blaascarcinoom) - die transfected waren om uit te drukken anker GPI dat uit DAF wordt afgeleid die aan GFP [genoemd wordt gesmolten GPI- (DAF) - GFP], een hoogst efficiënte teller van het lipidevlot [2] - waren gegroeid op glas-onderste Petrischalen. Vóór weergave, werden de cellen bevestigd met 4% paraformaldehyde voor 30 min.

Het topografische beeld (Figure1A) werd van de cellen verkregen gebruikend de Wijze van MAC Keysight. De weergavekracht was zo zacht dat de gloeidraden van cytoskeleton onderaan het plasmamembraan nauwelijks kunnen worden gezien. Lamellipodia bij de celgrens, echter, kan duidelijk worden ontdekt. Het niveau van GPI- (DAF) - de uitdrukking GFP in de cellen werd onderzocht door GFP fluorescentiebeelden (Figure1B) te verkrijgen.

Figuur 1. (a) de topografie van AFM van vaste T24 cellen die gpi-GFP uitdrukken (beeldgrootte: 50μm). Het beeld werd met de Wijze van MAC in PBS door een Keysight type VI te gebruiken de Hefboom die van MAC gemeten bij 16kHz en bij ongeveer 7nm met een weergavesnelheid oscilleert van 15μm/s. De weergavekracht was zo zacht dat de gloeidraden van cytoskeleton onderaan het plasmamembraan nauwelijks kunnen worden gezien. Lamellipodia bij de celgrens, echter, kan duidelijk worden ontdekt. (b) het beeld van de Fluorescentie (FITC filterreeks, 100 x vergroting) van de zelfde cellen die het uitdrukkingsniveau van gpi-GFP tonen. Sommige heldere gebieden dicht bij de kern wijzen op het endoplasmic netwerk (ER), waar de GPI-Verankerde proteïnen samengesteld zijn. Voorbij de gebieden van ER, kijkt de distributie van gpi-GFP in het plasmamembraan homogeen, behalve verscheidene heldere punten (b.v., die in het rode vierkant). (c) Door te gebruiken functionalized de cantilever met het anti-GFP antilichaam, het erkenningsbeeld van het gebied duidelijk met het rode vierkant in (b) geopenbaard nanodomains met een grootte van ongeveer 200300nm. In het gebied duidelijk met de gestormde blauwe cirkel, zijn nanodomains bijeengevoegd, die goed met microdomain correleert die in het fluorescentiebeeld wordt getoond. Tijdens de erkenningsweergave, oscilleerde de cantilever bij kHz 16 en bij ongeveer 7nm met een weergavesnelheid van de grootte van het Beeld 6.5μm/s.: 5μm.

Dicht bij de kern van de cellen zijn er sommige gebieden met zeer hoge fluorescentieintensiteit, die het feit in overeenstemming is met dat de GPI-Verankerde proteïnen in het endoplasmic netwerk dat de kern (ER) van de cellen (zie Figuur 2) samengesteld zijn omringt. Voorbij de gebieden van ER, is er geen correlatie tussen de topografische hoogte en de fluorescentieintensiteit, die dat het grootste deel van GPI- (DAF) voorstelt - de molecules GFP worden gevestigd in het plasmamembraan eerder dan in cytosol. Nu En Dan, kunnen sommige heldere fluorescentiepunten ver vanaf het gebied van ER worden gevonden, zoals duidelijk met het rode vierkant (Figure1B). Dergelijke heldere punten kunnen blaasje in cytosol of microdomain in het plasmamembraan zijn. In het algemeen, toont de conventionele fluorescentiemicroscopie met de hoogste vergroting (100x) een homogene distributie van GPI- (DAF) - GFP in het plasmamembraan.

Figuur 2. Schematisch diagram van de gecombineerde optische en atoomkrachtmicroscopie voor erkenningsmetingen op cel. GPI-verankerde GFP is samengesteld, gewijzigd, en vervoerd in ER in Golgi via blaasjes aan plasmamembraan. Terwijl de optische microscoop algemene van het uitdrukkingsniveau en de micrometer-schaal distributie van gpi-GFP door de fluorescentiemeting kan onderzoeken, antilichaam-functionalized de erkenningsweergave door cantilever kan de distributie van gpi-GFP bij de nanometerschaal visualiseren. Voor erkenningsweergave, oscilleert de cantilever bij constante omvang. Wanneer het antilichaam op het uiteinde met GFP op de celoppervlakte bindt, wordt het hogere deel van de schommelingsgolf verminderd. Dit kan worden ontdekt door de doos van Keysight PicoTREC, waar de schommelingsgolf in hogere en lagere delen verdeeld is. Het hogere deel van de schommelingsgolf wordt gebruikt om het erkenningsbeeld te construeren. Hier, worden de erkenningsgebeurtenissen getoond in rood.

Om de distributie van GPI- (DAF) te onderzoeken - GFP op het nanometerniveau, werd weergave TREC gebruikt. Het principe dat van weergave TREC een cantileveruiteinde gebruikt functionalized met antilichaam anti-GFP wordt getoond in Figuur 2. Tijdens weergave, oscilleert de cantilever (gedreven door een magnetisch veld) bij een constante omvang. Wanneer het antilichaam op het uiteinde met GFP op de celoppervlakte bindt, wordt het hogere deel van de schommeling verminderd. Dit kan worden ontdekt door de doos van Keysight PicoTREC, waar de schommelingsgolf in hogere en lagere delen verdeeld is. Van het hogere deel van de schommelingsgolf, kan het erkenningsbeeld worden geconstrueerd; het gebied met een bindende gebeurtenis wordt getoond als donkere vlek.

Het erkenningsbeeld van het gebied duidelijk met het rode vierkant in Figure1B wordt getoond in Figuur 1C. Van het erkenningsbeeld, kan men zien dat GPI- (DAF) - de molecules GFP vormen zich nanodomains met een grootte van ongeveer 200300nm. In het gebied duidelijk met de gestormde blauwe cirkel, zijn nanodomains bijeengevoegd, die als een microdomain in het fluorescentiebeeld kijkt. Zulk een microdomain verstrekt een unieke brug om de correlatie tussen de fluorescentie en erkenningsbeelden te tonen.

CD4 Molecules die met Gele Fluorescente Proteïne worden Gesmolten (YFP)

CD4 (cluster van differentiatie 4), speelt een glycoproteïne die oorspronkelijk op de oppervlakte van de helpercellen van T wordt gevonden, een zeer belangrijke rol in immunologie en de ziekte van HIV. De distributie van de CD4 proteïne werd onderzocht op T24 cellen die transfected waren om YFP-Gesmolten CD4 uit te drukken. Dergelijke cellen werden bevestigd en imaged door de fluorescentiemicroscopie en AFM te gebruiken. Van het brightfieldbeeld en het fluorescentiebeeld (Figuren 3A en 3B), vond men dat enkele cellen (b.v., cel 1 in Figuur 3) hoge uitdrukking van yfp-CD4 hebben, terwijl een andere cellen (b.v., cel 2 in Figuur 3) zeer lage uitdrukking hebben.

Figuur 3. (a) het beeld van Brightfield en (b) het fluorescentiebeeld van vaste T24 cellen transfected met yfp-CD4 openbaren dat enkele cellen (b.v., cel 1) hoge uitdrukking van yfp-CD4 hebben, terwijl een andere cellen (b.v., cel 2) zeer lage uitdrukking hebben. Met de begeleiding van de optische beelden, werden de krachtspectroscopie en de erkenningsweergave uitgevoerd op cel 1 en cel 2. Op cel 1, 244 werden de kracht-afstand krommen gemeten, waarvan 220 krommen bindende gebeurtenissen tonen, resulterend in een bindende waarschijnlijkheid van 90.2%. (FI) topografie AFM en erkennings de beelden die op cel 1 en cel 2 met een Keysight type VII de Hefboom van MAC worden gemeten functionalized met anti-CD4 antilichaam. De Beelden op de twee cellen werden gemeten met het zelfde uiteinde bij de zelfde frequentie (8kHz) en de omvang (ongeveer 50nm) met een weergavesnelheid van ongeveer 1.9μm/s. Cel 1 (paneel H) toonde vele grote erkenningsvlekken met een grootte die zich van 100 tot 200nm uitstrekt, terwijl cel 2 (paneel I) veel kleinere vlekken met afstand verder toonde.

Met de begeleiding van de optische beelden, werden de krachtspectroscopie en de erkenningsweergave uitgevoerd op cellen 1 en 2. Voor deze metingen, waren de cantileveruiteinden functionalized met anti-CD4 antilichaam. Op cel 1, 244 werden de kracht-afstand krommen gemeten, waarvan 220 krommen bindende gebeurtenissen tonen, resulterend in een bindende waarschijnlijkheid van 90.2% (3D Cijfer). Typische wordt een kracht-afstand kromme met een bindende gebeurtenis getoond in Cijfer 3C. Op cel 2, werden 241 krommen van de krachtafstand gemeten, waarvan slechts 10 krommen bindende gebeurtenissen tonen, resulterend in een bindende waarschijnlijkheid van 4.1%. Typische wordt een kracht-afstand kromme zonder een bindende gebeurtenis getoond in Figuur 3E. De kracht-afstand krommemetingen op de twee cellen werden uitgevoerd met het zelfde uiteinde. De Bindende waarschijnlijkheid voor cells1 en 2 is in zeer goede overeenkomst met de fluorescentieintensiteit.

De Cijfers 3F aan 3I tonen de topografie AFM en erkenningsbeelden die op cellen 1 en 2 worden gemeten. De Beelden op deze twee cellen werden gemeten met het zelfde uiteinde bij de zelfde frequentie en de omvang. Men vond dat er vele grote erkenningsvlekken op cel 1 (Cijfer 3H) met een grootte die zich van 100 tot 200nm uitstrekt zijn. De Meeste erkenningsvlekken worden gevestigd in gatengebieden in de topografie, maar de erkenningsvlekken kunnen ook in vooruitstekende gebieden in de topografie (Cijfer 3F) worden gevonden.

Veel van nanodomains worden reeds verbonden aan elkaar. Zulk een hoogte - de dichtheid van erkenningsvlekken valt met het sterke fluorescentiesignaal samen op cel 1, en is identiek met de hoge bindende waarschijnlijkheid van de krachtspectroscopie. Anderzijds, zijn de erkenningsvlekken op cel 2 (Figuur 3I) normaal kleiner dan die op cel 1, en de afstand tussen erkenningsvlekken is fundamenteel groter dan dat op cel 1. Het algemene gebied van erkenningsvlekken op cel 2 is veel minder dan dat op cel 1, die zeer goed met het uitdrukkingsniveau correleert dat door het fluorescentiebeeld wordt geopenbaard.

Om de specificiteit van de erkenningsvlekken verder te onderzoeken, werd een blokexperiment uitgevoerd door vrij anti-CD4 antilichaam in de metingsoplossing in te spuiten. Figuur 4 toont aan dat de topografie van het celmembraan na het blok gelijkaardig keek; nochtans, werden de erkenningsvlekken beduidend verminderd door het ingespoten vrije antilichaam. Voor weergave before and after het blok, werd de zelfde cantilever gebruikt bij de zelfde schommelingsfrequentie en de omvang. De duidelijke vermindering van de erkenningsvlekken bevestigde de specificiteit van erkenning-weergave-geopenbaarde CD4 nanodomains.

Figuur 4. (a) de Topografie en (b) de erkenningsbeelden op vaste T24 cellen die yfp-CD4 uitdrukken vóór blok, imaged door Keysight type VII de Hefboom van MAC functionalized met anti-CD4 antilichaam. Ongeveer 2.5 u na injectie van vrije anti-CD4 antilichamenmolecules (met een definitieve concentratie van 0.05mg/ml), (c) de topografie en (d) de erkenningsbeelden werden gemeten bij de zelfde positie met het zelfde cantileveruiteinde, dat significante vermindering van erkenningsvlekken toonde. Alle beelden werden gemeten bij een frequentie van de cantileverschommeling van 8.37kHz, een omvang van ongeveer 50nm, en met een weergavesnelheid van ongeveer 2.7μm/s.

Samenvatting

De volledig geïntegreerde combinatie atoomkrachtmicroscoop en omgekeerde lichte microscoopmogelijkheden die door Keysight 6000ILM AFM wordt veroorloofd liet onlangs een gemakkelijk en snel onderzoek van de distributie van de proteïnen van het celmembraan bij de micrometer en nanometerschalen toe. De eenvoudige en geschikte verrichting van dit nieuwe instrument zal tot het het aangewezen hulpmiddel van biologen en biophysicists voor talrijke toekomstige toepassingen in het levenswetenschap bij nanoscale maken, daardoor overbruggend de werelden van optica en atoomresolutie in de fysiologische omstandigheden.

Verwijzingen

1. Linda Wildling, Barbara Unterauer, Rong Zhu, Anne Rupprecht, Thomas Haselgrübler, Christian Rankl, Andreas Ebner, Doris Vater, Philipp Pollheimer, Elena E. Pohl, Peter Hinterdorfer, en Hermann J. Gruber, „het Verbinden van sensormolecules met aminogroepen aan amino-functionalized uiteinden AFM,“ Bioconjugate Chem 22 (2011): 1239-1248.
2. Julian Weghuber, Stefan Sunzenauer, Birgit Plochberger, Mario Brameshuber, Thomas Haselgrübler, en Gerhard J. Schütz, „Tijdelijke resolutie van eiwit eiwitinteractie in het membraan van het levend-celplasma,“ Anale Bioanal Chem 397 (2010): 3339-3347.

Ongeveer Technologieën Keysight

Keysight is een globale elektronische van de metingstechnologie en markt leider die de metingservaring van zijn klanten door innovatie helpt om te zetten in draadloze, modulaire, en softwareoplossingen. Keysight verleent elektronische metingsinstrumenten en systemen en verwante software, van het softwareontwerp hulpmiddelen en de diensten die in het ontwerp, de ontwikkeling, de vervaardiging, de installatie, de plaatsing en de verrichting van elektronische apparatuur worden gebruikt. De Informatie over Keysight is beschikbaar in www.keysight.com.

Bron: De Technologieën van Keysight

Voor meer informatie over deze bron te bezoeken gelieve Technologieën Keysight.

Date Added: May 17, 2012 | Updated: Dec 16, 2014

Last Update: 16. December 2014 12:29

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit