Espectroscopia da Força & Imagem Lactente Fluorescência-Guiadas do Reconhecimento em Pilhas através de ILM/AFM

Patrocinado por Tecnologias de Keysight

Assuntos Cobertos

Introdução
    Microscopia de Fluorescência na Análise da Pilha Viva
    Combinando métodos do AFM com a Imagem Lactente do Reconhecimento da Fluorescência
Vista Geral das Experiências
Proteína Fluorescente Verde Ancorada de Glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GFP)
Moléculas CD4 Fundidas com Proteína Fluorescente Amarela (YFP)
Sumário
Referências
Sobre Tecnologias de Keysight

Introdução

Microscopia de Fluorescência na Análise da Pilha Viva

A microscopia de Fluorescência transformou-se uma ferramenta importante para localizar interacções do receptor/ligante em pilhas vivas. Etiquetar proteínas diferentes com fluorophores espectrais diferentes permite a imagem lactente de componentes diferentes e da determinação celulares, subcelulares, ou moleculars da localização específica das proteínas nas pilhas. A rejeção de indesejável, fundo do curto-comprimento de onda (dispersão de Rayleigh da luz da excitação) pela filtração espectral melhora o contraste de estruturas celulares especificamente etiquetadas na microscopia de fluorescência. As definições laterais e axiais são limitadas pelo limite de difracção de luz e de resultado na definição de ~200nm. Recentemente, as técnicas com mais de alta resolução foram desenvolvidas, como a prostração da emissão estimulada (STED), foto-activaram a microscopia da localização (PALM), e a microscopia óptica estocástica da reconstrução (TEMPESTADE), que conseguem a definição lateral de 10-30nm.

Combinando métodos do AFM com a Imagem Lactente do Reconhecimento da Fluorescência

As técnicas Ópticas, contudo, não podem fornecer nenhuma informação da topografia da amostra. Pelo contraste, a microscopia atômica da força (AFM) permite que as imagens topográficas sejam obtidas na escala do nanômetro em ambientes líquidos e na temperatura ambiente. Além, o reconhecimento do receptor/pares da ligante pode ser investigado a nível da único-molécula.

Uma técnica de imagem lactente simultânea recentemente desenvolvida da topografia e do reconhecimento, executada utilizando PicoTREC das Tecnologias de Keysight para o trabalho detalhado nisto, é capaz de render uma imagem topográfica assim como um mapa de locais de reconhecimento da mesma área com uma única varredura na definição da lateral 5nm. O princípio de funcionamento da técnica nova é o mesmo que para a imagem lactente dinâmica do AFM do modo. Um modilhão é oscilado perto de sua freqüência da ressonância e feito a varredura sobre a superfície da amostra, mas o modilhão é feito neste caso quimicamente sensível anexando uma ligante através de um linker curto a sua ponta. Os locais obrigatórios são evidentes da redução da amplitude da oscilação. O tratamento dos sinais Aumentado, em combinação com um laço de feedback alterado, fornece uma imagem do reconhecimento adquirida simultaneamente ao lado de uma imagem da topografia.

Essencialmente, a separação de eventos topográficos e do reconhecimento é conseguida rachando a amplitude da oscilação do modilhão em umas mais baixas e partes superiores (no que diz respeito à posição de descanso do modilhão). Os máximos destas peças são usados então para gravar ao mesmo tempo a topografia (partes mais inferiores) e a imagem do reconhecimento (partes superiores).

Este artigo discute a capacidade do microscópio atômico da força de Keysight 6000ILM para posicionar facilmente a ponta do AFM às regiões de interesse usando uma imagem óptica contraste-aumentada e uma imagem da fluorescência, e a espectroscopia subseqüente da imagem lactente e da força de TREC, que mostram a correlação alta entre a intensidade da fluorescência, probabilidade obrigatória, e área do reconhecimento, assim como o visualização dos nanodomains reconhecidos sobre pilhas com níveis diferentes de expressão da proteína.

Vista Geral das Experiências

Um dos assuntos os mais intrigantes na ciência da vida e no bionanotechnology é a investigação das pilhas e da organização e função das proteínas na membrana de pilha. A sinalização da Pilha, uma comunicação às pilhas vizinhas, e o transporte ao tecido adjacente são organizados toda através das proteínas da membrana. Dois exemplos de sistemas importantes da proteína para a sinalização da pilha e a organização da membrana de pilha são apresentados aqui.

As experiências do AFM foram executadas usando um Keysight 6000ILM AFM montado em um Observador A1 (para a medida das pilhas com GPI-GFP) ou a de Zeiss Axio ATÉ o microscópio de Photonicsfluorescence (para a medida das pilhas com YFP-CD4). Todas As imagens foram adquiridas em PBS na temperatura ambiente usando o Modo do MAC de Keysight (isto é, C.A. magnética). O tipo VI e VII de Keysight Alavancas do MAC foi utilizado e as imagens do AFM foram adquiridas usando o software de Keysight PicoView. Os Modilhões para a espectroscopia da força foram lavados no clorofórmio três vezes, secadas no ar, lavado na piranha (30% HO e22 70% HSO)2 para4 o minuto 30, enxaguado com água, e secado aquecendo nos Modilhões 100°C. para a imagem lactente de TREC foram lavados no clorofórmio três vezes e secados no ar. Todos Os modilhões então foram tratados com o APTES, conjugaram com aldeído de NHS-PEG- ou NHS-PEG-acetal, e ligaram subseqüentemente com o anticorpo [1].

Proteína Fluorescente Verde Ancorada de Glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GFP)

Na membrana de plasma das pilhas, há colesterol e os domínios sphingolipid-enriquecidos, denominados lipido do ` transportam'. Estas jangada do lipido servem como centros de organização para o conjunto de moléculas da sinalização, influenciam a fluidez da membrana e a proteína da membrana traficando, e igualmente influenciam o tráfico do receptor. Por exemplo, em cima da provocação específica, os receptors da membrana tais como os receptors De Célula T ou os receptors da B-Pilha translocate em jangada do lipido, que é a condição prévia para a transdução receptor-negociada eficiente do sinal.

O Keysight 6000ILM AFM permitiu a investigação da morfologia e da distribuição de jangada do lipido em pilhas. Para isto, pilhas T24 (pilhas humanas da carcinoma da bexiga) - que transfected para expressar a âncora derivada do DAF fundido a GFP [denominado GPI- (DAF) - GFP], um marcador altamente eficaz de GPI da jangada do lipido [2] - foram crescidos em pratos de Petri da vidro-parte inferior. Antes da imagem lactente, as pilhas foram fixadas com paraformaldehyde de 4% por 30 Min.

A imagem topográfica (Figure1A) das pilhas foi obtida usando o Modo do MAC de Keysight. A força da imagem lactente era tão delicada que os filamentos do cytoskeleton debaixo da membrana de plasma podem mal ser vistos. Lamellipodia na beira da pilha, contudo, pode claramente ser detectado. O nível de GPI- (DAF) - expressão de GFP nas pilhas foi examinado obtendo as imagens da fluorescência de GFP (Figure1B).

Figura 1. (a) topografia do AFM das pilhas T24 fixas que expressam GPI-GFP (tamanho da imagem: 50μm). A imagem foi medida com Modo do MAC em PBS usando um tipo Alavanca de Keysight do MAC de VI que oscila em 16kHz e aproximadamente em 7nm com uma velocidade da imagem lactente de 15μm/s. A força da imagem lactente era tão delicada que os filamentos do cytoskeleton debaixo da membrana de plasma podem mal ser vistos. Lamellipodia na beira da pilha, contudo, pode claramente ser detectado. (b) Imagem da Fluorescência (grupo do filtro de FITC, ampliação de 100 x) das mesmas pilhas que mostram o nível da expressão de GPI-GFP. Algumas regiões brilhantes perto do núcleo indicam o segundo estômago endoplasmic (ER), onde as proteínas GPI-ancoradas são sintetizadas. Além das regiões do ER, a distribuição de GPI-GFP na membrana de plasma olha homogênea, à exceção de diversos pontos brilhantes (por exemplo, aqueles no quadrado vermelho). (c) Usando o modilhão functionalized com o anti-GFP anticorpo, a imagem do reconhecimento da região identificada por meio do quadrado vermelho em (b) revelou nanodomains com um tamanho aproximadamente de 200-300nm. Na região identificada por meio do círculo azul tracejado, os nanodomains foram agregados, que correlaciona bem ao microdomain mostrado na imagem da fluorescência. Durante a imagem lactente do reconhecimento, o modilhão estava oscilando em 16 quilohertz e aproximadamente 7nm com uma velocidade da imagem lactente do tamanho da Imagem 6.5μm/s.: 5μm.

Perto do núcleo das pilhas há algumas regiões com intensidade muito alta da fluorescência, que é de acordo com o facto de que as proteínas GPI-ancoradas estão sintetizadas no segundo estômago endoplasmic (ER) que cerca o núcleo das pilhas (veja Figura 2). Além das regiões do ER, não há nenhuma correlação entre a altura topográfica e a intensidade da fluorescência, que sugere que a maioria do GPI- (DAF) - moléculas de GFP é ficada situada na membrana de plasma um pouco do que no cytosol. Ocasionalmente, alguns pontos brilhantes da fluorescência podem ser encontrados longe da região do ER, como identificados por meio do quadrado vermelho (Figure1B). Tais pontos brilhantes podem ser vesícula no cytosol ou microdomain na membrana de plasma. Geralmente, a microscopia de fluorescência convencional com a ampliação a mais alta (100x) mostra uma distribuição homogênea de GPI- (DAF) - GFP na membrana de plasma.

Figura 2. diagrama Esquemático da microscopia óptica e atômica combinada da força para medidas do reconhecimento na pilha. GFP GPI-ancorado é sintetizado no ER, alterado em Golgi, e transportado através das vesículas à membrana de plasma. Quando o microscópio óptico puder examinar a distribuição total do nível e da micrômetro-escala da expressão de GPI-GFP com a medida da fluorescência, a imagem lactente do reconhecimento pelo modilhão do anticorpo-functionalized pode visualizar a distribuição de GPI-GFP na escala do nanômetro. Para a imagem lactente do reconhecimento, o modilhão oscila na amplitude constante. Quando o anticorpo na ponta liga com o GFP na superfície da pilha, a parte superior da onda da oscilação está reduzida. Isto pode ser detectado pela caixa de Keysight PicoTREC, onde a onda da oscilação é separação em partes superiores e mais inferiores. A parte superior da onda da oscilação é usada para construir a imagem do reconhecimento. Aqui, os eventos do reconhecimento são mostrados no vermelho.

Para investigar a distribuição de GPI- (DAF) - GFP a nível do nanômetro, a imagem lactente de TREC foi utilizada. O princípio de imagem lactente de TREC que usa uma ponta do modilhão functionalized com anti-GFP anticorpo é mostrado em Figura 2. Durante a imagem lactente, o modilhão oscila (conduzido por um campo magnético) em uma amplitude constante. Quando o anticorpo na ponta liga com o GFP na superfície da pilha, a parte superior da oscilação está reduzida. Isto pode ser detectado pela caixa de Keysight PicoTREC, onde a onda da oscilação é separação em partes superiores e mais inferiores. Da parte superior da onda da oscilação, a imagem do reconhecimento pode ser construída; a área com um evento obrigatório é mostrada como um ponto escuro.

A imagem do reconhecimento da região identificada por meio do quadrado vermelho em Figure1B é mostrada na Figura 1C. Da imagem do reconhecimento, pode-se ver que o GPI- (DAF) - moléculas de GFP forma nanodomains com um tamanho aproximadamente de 200-300nm. Na região identificada por meio do círculo azul tracejado, os nanodomains foram agregados, que olha como um microdomain na imagem da fluorescência. Tal microdomain fornece uma ponte original para mostrar a correlação entre a fluorescência e as imagens do reconhecimento.

Moléculas CD4 Fundidas com Proteína Fluorescente Amarela (YFP)

CD4 (conjunto da diferenciação 4), uma glicoproteína originalmente encontrou na superfície de pilhas de ajudante de T, joga um papel muito importante na imunologia e a doença do VIH. A distribuição da proteína CD4 foi investigada nas pilhas T24 que transfected para expressar CD4 YFP-fundido. Tais pilhas eram fixas e imaged usando a microscopia de fluorescência e o AFM. Da imagem do brightfield e da imagem da fluorescência (Figuras 3A e 3B), encontrou-se que algumas das pilhas (por exemplo, pilha 1 em Figura 3) têm a expressão alta de YFP-CD4, quando algumas outras pilhas (por exemplo, pilha 2 em Figura 3) tiverem a expressão muito baixa.

A Figura 3. (a) imagem de Brightfield e (b) imagem da fluorescência das pilhas T24 fixas transfected com YFP-CD4 revela que algumas das pilhas (por exemplo, pilha 1) têm a expressão alta de YFP-CD4, quando algumas outras pilhas (por exemplo, pilha 2) tiverem a expressão muito baixa. Com a orientação das imagens ópticas, a espectroscopia da força e a imagem lactente do reconhecimento foram executadas na pilha 1 e na pilha 2. Na pilha 1, 244 curvas da força-distância foram medidas, de que 220 eventos obrigatórios da mostra das curvas, tendo por resultado uma probabilidade obrigatória de 90,2%. (F-I) As imagens da topografia e do reconhecimento do AFM medidas na pilha 1 e na pilha 2 com um tipo Alavanca de Keysight do MAC de VII functionalized com o anticorpo anti-CD4. As Imagens nas duas pilhas foram medidas com a mesma ponta na mesma freqüência (8kHz) e na amplitude (sobre 50nm) com uma velocidade da imagem lactente aproximadamente 1.9μm/s. da Pilha 1 (o painel H) mostrou muitos grandes pontos do reconhecimento com um tamanho que varia de 100 a 200nm, quando a pilha 2 (o painel I) mostrou pontos muito menores com distância mais distante.

Com a orientação das imagens ópticas, a espectroscopia da força e a imagem lactente do reconhecimento foram executadas nas pilhas 1 e 2. Para estas medidas, as pontas do modilhão functionalized com o anticorpo anti-CD4. Na pilha 1, 244 curvas da força-distância foram medidas, de que 220 eventos obrigatórios da mostra das curvas, tendo por resultado uma probabilidade obrigatória de 90,2% (Figura 3D). Uma curva típica da força-distância com um evento obrigatório é mostrada na Figura 3C. Na pilha 2, 241 curvas da distância da força foram medidas, de que somente 10 eventos obrigatórios da mostra das curvas, tendo por resultado uma probabilidade obrigatória de 4,1%. Uma curva típica da força-distância sem um evento obrigatório é mostrada na Figura 3E. As medidas da curva da força-distância nas duas pilhas foram executadas com a mesma ponta. A probabilidade Obrigatória para cells1 e 2 está no acordo muito bom com a intensidade da fluorescência.

As Figuras 3F à mostra 3I as imagens da topografia e do reconhecimento do AFM medidas em Imagens das pilhas 1 e 2. nestas duas pilhas foram medidas com a mesma ponta na mesma freqüência e na amplitude. Encontrou-se que há muitos grandes pontos do reconhecimento na pilha 1 (Figura 3H) com um tamanho que varia de 100 a 200nm. A Maioria dos pontos do reconhecimento são ficados situados em regiões do furo na topografia, mas os pontos do reconhecimento podem igualmente ser encontrados em regiões de projecção na topografia (Figura 3F).

Muitos dos nanodomains são conectados já um com o otro. Tal alto densidade de pontos do reconhecimento coincide com o sinal forte da fluorescência na pilha 1, e é idêntico com a probabilidade obrigatória alta da espectroscopia da força. Por outro lado, os pontos do reconhecimento na pilha 2 (Figura 3I) são normalmente menores do que aqueles na pilha 1, e a distância entre pontos do reconhecimento são basicamente maiores do que aquele na pilha 1. A área total de pontos do reconhecimento na pilha 2 é muito menos do que aquela na pilha 1, que correlaciona muito bem ao nível da expressão revelado pela imagem da fluorescência.

Para examinar mais a especificidade dos pontos do reconhecimento, uma experiência do bloco foi executada injetando o anticorpo anti-CD4 livre na solução da medida. Figura 4 mostra que a topografia da membrana de pilha olhou similar após o bloco; contudo, os pontos do reconhecimento foram reduzidos significativamente pelo anticorpo livre injetado. Para a imagem lactente antes e depois de que o bloco, o mesmo modilhão foi usado na mesmas freqüência e amplitude da oscilação. A redução clara dos pontos do reconhecimento confirmou a especificidade dos nanodomains CD4 reconhecimento-imagem-revelados.

A Figura 4. (a) Topografia e (b) imagens do reconhecimento nas pilhas T24 fixas que expressam YFP-CD4 antes de bloco, imaged pelo tipo Alavanca de Keysight do Mac de VII functionalized com o anticorpo anti-CD4. Aproximadamente 2,5 horas após a injecção de moléculas livres do anticorpo anti-CD4 (com uma concentração final de 0.05mg/ml), (c) de topografia e (d) de imagens do reconhecimento foram medidas na mesma posição com a mesma ponta do modilhão, que mostrou a redução significativa de pontos do reconhecimento. Todas As imagens foram medidas em uma freqüência de 8.37kHz, uma amplitude da oscilação do modilhão aproximadamente de 50nm, e com uma velocidade da imagem lactente aproximadamente de 2.7μm/s.

Sumário

A combinação inteiramente integrada de microscópio atômico da força e de capacidades invertidas do fotomicroscópio tidos recursos para pelo Keysight 6000ILM AFM permitiu recentemente uma investigação fácil e rápida da distribuição de proteínas da membrana de pilha nas escalas do micrômetro e do nanômetro. O funcionamento simples e conveniente deste instrumento novo far-lhe-á a ferramenta preferida dos biólogos e dos biofísicos para aplicações futuras numerosas na ciência da vida no nanoscale, desse modo construindo uma ponte sobre os mundos dos sistemas óticos e da definição atômica sob circunstâncias fisiológicos.

Referências

1. Linda Wildling, Barbara Unterauer, Rong Zhu, Anne Rupprecht, Thomas Haselgrübler, Cristão Rankl, Andreas Ebner, Doris Vater, Philipp Pollheimer, Elena E. Pohl, Peter Hinterdorfer, e Hermann J. Gruber, “Ligamento de moléculas do sensor com os grupos aminados ao amino-functionalized AFM derruba,” Bioconjugate Chem 22 (2011): 1239-1248.
2. Weghuber Juliano, Stefan Sunzenauer, Birgit Plochberger, Mario Brameshuber, Thomas Haselgrübler, e Gerhard J. Schütz, “definição Temporal de interacções da proteína da proteína na membrana de plasma da vivo-pilha,” Bioanal Anal Chem 397 (2010): 3339-3347.

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Source: Tecnologias de Keysight

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Date Added: May 17, 2012 | Updated: Dec 16, 2014

Last Update: 16. December 2014 12:31

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