Флуоресцировани-Направленные Спектроскопия Усилия & Воображение Опознавания на Клетках через ILM/AFM

Спонсировано Технологиями Keysight

Покрытые Темы

Введение
    Микроскопия Флуоресцирования в Анализе Живущей Клетки
    Совмещать методы AFM с Воображением Опознавания Флуоресцирования
Обзор Экспериментов
Протеин Glycosylphosphatidylinositol (GPI) Поставленный на якорь Зеленый Дневной (GFP)
Молекулы CD4 Сплавленные с Желтым Дневным Протеином (YFP)
Сводка
Справки
О Технологиях Keysight

Введение

Микроскопия Флуоресцирования в Анализе Живущей Клетки

Микроскопия Флуоресцирования стала важным инструментом для локализовать взаимодействия приемного устройства/лиганда в живущих клетках. Обозначать различные протеины с различными спектральными fluorophores позволяет воображению различных клетчатых, субцеллюлярных, или молекулярных компонентов и определения специфической локализации протеинов в клетках. Сброс излишнего, предпосылка коротк-длины волны (Рэлеевское рассеяние света возбуждения) спектральный фильтровать улучшает контраст специфически обозначенных сетчатых микроструктур в микроскопии флуоресцирования. Боковые и осевые разрешения ограничены пределом огибания света и результата в разрешении ~200nm. Недавно, методы с более высоким разрешением были начаты, как расход вынужденного излучения (STED), фото-активировали микроскопию локализацией (PALM), и стохастическую оптически микроскопию реконструкции (ШТОРМ), которая достигают бокового разрешения 10-30nm.

Совмещать методы AFM с Воображением Опознавания Флуоресцирования

Оптически методы, однако, не могут обеспечить любую информацию топографии образца. контрастом, атомная микроскопия усилия (AFM) позволяет топографическим изображениям быть полученным на маштабе нанометра в жидкостных окружающих средах и на комнатной температуре. В добавлении, опознавание пар приемного устройства/лиганда можно расследовать на уровне одиночн-молекулы.

Недавно начатый одновременный выполненный метод воображения топографии и опознавания, использующ PicoTREC от Технологий Keysight для работы детализированной здесь, способен производить топографическое изображение так же, как карту мест опознавания такой же зоны с одиночной разверткой на разрешении боковой части 5nm. Принцип действия нового метода это же как для динамического воображения AFM режима. Cantilever осциллирован около своей частоты резонанса и просмотрен над поверхностью образца, но в этот случай cantilever сделан химически чувствительным путем прикреплять лиганд через короткий линкер к своей подсказке. Связующие сайты очевидны от уменьшения амплитуды колебания. Увеличенная обработка сигнала, в комбинации с доработанной цепью обратной связи, обеспечивает изображение опознавания одновременно приобретенное наряду с изображением топографии.

Существенно, разъединение случаев топографических и опознавания достигано путем разделять амплитуду колебания cantilever в более низкие и верхние части (по отношению к нейтральному положению cantilever). Максимумы этих частей после этого использованы для того чтобы записать топографию (нижние части) и изображение опознавания (верхние части) в тоже время.

Эта статья обсуждает способность микроскопа усилия Keysight 6000ILM атомного легко расположить подсказку AFM к зонам интереса используя контраст-увеличенное оптически изображение и изображение флуоресцирования, и последующую спектроскопию воображения и усилия TREC, которая показывают высокую корреляцию среди интенсивности флуоресцирования, binding вероятности, и зоны опознавания, так же, как визуализирование узнанных nanodomains на клетки с различными уровнями выражения протеина.

Обзор Экспериментов

Одна из интригуя тем в науках о жизни и bionanotechnology исследование клеток и организации и функция протеинов в мембране клетки. Signaling Клетки, сообщение к соседским клеткам, и переход к смежной ткани совсем организованы через протеины мембраны. 2 примера важных систем протеина для signaling клетки и организации мембраны клетки здесь.

Эксперименты по AFM были выполнены используя Keysight 6000ILM AFM установленное на Наблюдателе A1 (для измерения клеток с GPI-GFP) или a Zeiss Axio ДО микроскопа Photonicsfluorescence (для измерения клеток с YFP-CD4). Все изображения были приобретены в PBS на комнатной температуре используя Режим MAC Keysight (т.е., магнитный AC). Тип VI и VII Keysight Рукоятки MAC был использован и изображения AFM были приобретены используя ПО Keysight PicoView. Cantilevers для спектроскопии усилия были помыты в хлороформе 3 времени, высушенного в воздухе, помытом в piranha (30% HO и22 70% HSO)2 на4 минута 30, прополосканном с водой, и высушено путем нагревать на Cantilevers 100°C. для воображения TREC помыл в хлороформе 3 времени и было высушен в воздухе. Все cantilevers после этого были обработаны с APTES, проспрягали с альдегидом NHS-PEG- или NHS-ШПЕНЬК-винилацеталем, и затем соединили с антителом [1].

Протеин Glycosylphosphatidylinositol (GPI) Поставленный на якорь Зеленый Дневной (GFP)

В мембране плазмы клеток, холестерол и sphingolipid-обогащенные термин домены, липидом ` сплавляют'. Эти сплотки липида служят как организуя центры для агрегата молекул signaling, влияют на текучесть мембраны и протеин мембраны торгуя, и также влияют на торговать приемного устройства. Например, на специфический вызывать, приемные устройства мембраны как приемные устройства T-Клетки или приемные устройства B-Клетки перемещают в сплотки липида, который предпосылка для эффективного приемн-посредничанного transduction сигнала.

Keysight 6000ILM AFM позволило исследованию как словотолкования, так и распределения сплотков липида на клетках. Для этого, клеток T24 (людские клетки карциномы пузыря) - которые были transfected для того чтобы выразить анкер выведенный от сплавленного DAF к термин GFP [GPI- (DAF) - GFP], сильно эффективную отметку GPI сплотка липида [2] - росл на Чашка Петри стекл-дна. Перед воображением, клетки были зафиксированы с параформальдегидом 4% на 30 MIN.

Топографическое изображение (Figure1A) клеток было получено используя Режим MAC Keysight. Усилие воображения было настолько нежно что нити цитоскелета под мембраной плазмы можно едва ли увидеть. Lamellipodia на границе клетки, однако, можно ясно обнаружить. Уровень GPI- (DAF) - выражение GFP в клетках был расмотрен путем получать изображения флуоресцирования GFP (Figure1B).

Диаграмма 1. (A) топография AFM фикчированных клеток T24 выражая GPI-GFP (размер изображения: 50μm). Изображение было измерено с Режимом MAC в PBS путем использование типа Рукоятки Keysight MAC VI осциллируя на 16kHz и на около 7nm с скоростью воображения 15μm/s. Усилие воображения было настолько нежно что нити цитоскелета под мембраной плазмы можно едва ли увидеть. Lamellipodia на границе клетки, однако, можно ясно обнаружить. (B) Изображение Флуоресцирования (комплект фильтра FITC, увеличение 100 x) таких же клеток показывая уровень выражения GPI-GFP. Некоторые яркие зоны близко к ядру показывают эндоплазменный ретикулум (ER), где GPI-поставленные на якорь протеины синтезированы. За зонами ER, распределение GPI-GFP в мембране плазмы смотрит однотиповым, за исключением нескольких ярких многоточий (например, тех в красном квадрате). (C) Путем использование cantilever functionalized с анти--GFP антителом, изображение опознавания зоны маркированной с красным квадратом в (B) показанных nanodomains с размером около 200-300nm. В зоне маркированной с брошенным голубым кругом, были суммированы nanodomains, который сопоставляет хорошо к microdomain показанному в изображении флуоресцирования. Во Время воображения опознавания, cantilever осциллировал на 16 КГц и на около 7nm с скоростью воображения размера Изображения 6.5μm/s.: 5μm.

Близко к ядру клеток некоторые зоны с очень высокой интенсивностью флуоресцирования, которая в соответствии с фактом что GPI-поставленные на якорь протеины синтезированы в эндоплазменном ретикулуме (ER) окружая ядро клеток (см. Диаграмму 2). За зонами ER, никакая корреляция между топографической высотой и интенсивностью флуоресцирования, которая предлагает что большое часть из GPI- (DAF) - молекулы GFP расположена в мембране плазмы вернее чем в cytosol. Изредка, некоторые яркие многоточия флуоресцирования можно найти далеко далеко от зоны ER, как маркировано с красным квадратом (Figure1B). Такие яркие многоточия могут быть vesicle в cytosol или microdomain в мембране плазмы. Вообще, обычная микроскопия флуоресцирования с самым высоким увеличением (100x) показывает однотиповое распределение GPI- (DAF) - GFP в мембране плазмы.

Диаграмма 2. Схематическая диаграмма совмещенной оптически и атомной микроскопии усилия для измерений опознавания на клетке. GPI-поставленное на якорь GFP синтезировано в ER, доработано в Golgi, и транспортировано через vesicles к мембране плазмы. Пока оптически микроскоп может рассмотреть общее распределение уровня и микрометр-маштаба выражения GPI-GFP через измерение флуоресцирования, воображение опознавания cantilever антитела-functionalized может визуализировать распределение GPI-GFP на маштабе нанометра. Для воображения опознавания, cantilever осциллирует на постоянн амплитуде. Когда антитело на подсказке связывает с GFP на поверхности клетки, уменьшена верхняя часть волны колебания. Это может быть обнаружено коробкой Keysight PicoTREC, где волна колебания разделена в верхние и нижние части. Верхняя часть волны колебания использована для того чтобы построить изображение опознавания. Здесь, случаи опознавания показаны в красном цвете.

Для того чтобы расследовать распределение GPI- (DAF) - GFP на уровне нанометра, было использовано воображение TREC. Принцип воображения TREC используя консольную подсказку functionalized с анти--GFP антителом показан в Диаграмме 2. Во Время воображения, cantilever осциллирует (управлено магнитным полем) на постоянн амплитуде. Когда антитело на подсказке связывает с GFP на поверхности клетки, уменьшена верхняя часть колебания. Это может быть обнаружено коробкой Keysight PicoTREC, где волна колебания разделена в верхние и нижние части. От верхней части волны колебания, изображение опознавания можно построить; зона с binding случаем показана как темное пятно.

Изображение опознавания зоны маркированной с красным квадратом в Figure1B показано в Диаграмме 1C. От изображения опознавания, его можно увидеть что GPI- (DAF) - молекулы GFP формирует nanodomains с размером около 200-300nm. В зоне маркированной с брошенным голубым кругом, были суммированы nanodomains, который смотрит как microdomain в изображении флуоресцирования. Такое microdomain обеспечивает уникально мост для того чтобы показать корреляцию между флуоресцированием и изображениями опознавания.

Молекулы CD4 Сплавленные с Желтым Дневным Протеином (YFP)

CD4 (группа дифференцирования 4), гликопротеид первоначально найденный на поверхности клеток хелпера T, игры очень важная роль в иммунологии и заболевание ВИЧ. Распределение протеина CD4 было расследовано на клетках T24 которые были transfected для того чтобы выразить YFP-сплавленное CD4. Такие клетки были фикчированы и imaged путем использование микроскопии флуоресцирования и AFM. От изображения brightfield и изображения флуоресцирования (Диаграмм 3A и 3B), было найдено что некоторые из клеток (например, клетка 1 в Диаграмме 3) имеет высокое выражение YFP-CD4, пока некоторые другие клетки (например, клетка 2 в Диаграмме 3) имеет очень низкое выражение.

Диаграмма 3. (A) изображение Brightfield и изображение флуоресцирования (B) фикчированных клеток T24 transfected с YFP-CD4 показывает что некоторые из клеток (например, клетка 1) имеет высокое выражение YFP-CD4, пока некоторые другие клетки (например, клетка 2) имеет очень низкое выражение. С наведением оптически изображений, спектроскопия усилия и воображение опознавания были выполнены на клетке 1 и клетке 2. На клетке 1, 244 кривого усили-расстояния были измерены, от которой 220 случаев выставки кривых binding, приводящ к в binding вероятности 90,2%. (F-I) Изображения топографии и опознавания AFM измеренные на клетке 1 и клетке 2 с типом Рукояткой Keysight MAC VII functionalized с антителом anti-CD4. Изображения на 2 клетках были измерены с такой же подсказкой на такой же частоте (8kHz) и амплитуда (о 50nm) с скоростью воображения около 1.9μm/s. Клетки 1 (панель H) показала много больших пятен опознавания при размер колебаясь от 100 к 200nm, пока клетка 2 (панель I) показала гораздо малее пятна с более далеким расстоянием.

С наведением оптически изображений, спектроскопия усилия и воображение опознавания были выполнены на клетках 1 и 2. Для этих измерений, консольные подсказки были functionalized с антителом anti-CD4. На клетке 1, 244 кривого усили-расстояния были измерены, от которой 220 случаев выставки кривых binding, приводящ к в binding вероятности 90,2% (Диаграмма 3D). Типичная кривый усили-расстояния с binding случаем показана в Диаграмме 3C. На клетке 2, были измерены 241 кривый расстояния усилия, от которой только 10 случаев выставки кривых binding, приводящ к в binding вероятности 4,1%. Типичная кривый усили-расстояния без binding случая показана в Диаграмме 3E. Измерения кривого усили-расстояния на 2 клетках были выполнены с такой же подсказкой. Binding вероятность для cells1 и 2 в очень хорошем соответствии с интенсивностью флуоресцирования.

Диаграммы 3F к выставке 3I измеренные изображения топографии и опознавания AFM на Изображениях клеток 1 и 2. на этих 2 клетках были измерены с такой же подсказкой на такой же частоте и амплитуде. Было найдено что много больших пятен опознавания на клетке 1 (Диаграмма 3H) при размер колебаясь от 100 к 200nm. Большое Часть из пятен опознавания расположена в зонах отверстия в топографии, но пятна опознавания можно также найти в выступая зонах в топографии (Диаграмме 3F).

Много из nanodomains уже соединены друг с другом. Такая высокая плотность пятен опознавания совпадает с сильным сигналом флуоресцирования на клетке 1, и идентична с высокой binding вероятностью от спектроскопии усилия. С другой стороны, пятна опознавания на клетке 2 (Диаграмма 3I) нормально более малы чем пятнна клетке 1, и расстояние между пятнами опознавания по-существу большле чем пятнна клетке 1. Общая зона пятен опознавания на клетке 2 очень чем то на клетке 1, которая сопоставляет очень хорошо к уровню выражения показанному изображением флуоресцирования.

Более далее для того чтобы рассмотреть характерность пятен опознавания, эксперимент по блока был выполнен путем впрыскивать свободное антитело anti-CD4 в разрешение измерения. На Диаграмму 4 показано что топография мембраны клетки посмотрела подобной после блока; однако, пятна опознавания значительно были уменьшены впрыснутым свободным антителом. Для воображения прежде и после блок, такой же cantilever был использован на таких же частоте и амплитуде колебания. Ясное уменьшение пятен опознавания подтвердило характерность опознавани-воображени-показанных nanodomains CD4.

Диаграмма 4. изображения Топографии (A) и опознавания (B) на фикчированных клетках T24 выражая YFP-CD4 перед блоком, imaged типом Рукояткой Keysight Mac VII functionalized с антителом anti-CD4. Около через 2,5 часа после впрыски свободных изображений молекул (с окончательной концентрацией 0.05mg/ml), топографии (C) и опознавания (D) антитела anti-CD4 были измерены на таком же положении с такой же консольной подсказкой, которая показала значительно уменьшение пятен опознавания. Все изображения были измерены на консольной частоте 8.37kHz, амплитуде колебания около 50nm, и с скоростью воображения около 2.7μm/s.

Сводка

Микроскоп усилия польностью интегрированного сочетание из атомный и перевернутые возможности светлого микроскопа позволянные Keysight 6000ILM AFM недавно включили легкое и быстрое исследование распределения протеинов мембраны клетки на маштабах микрометра и нанометра. Простая и удобная деятельность этой новой аппаратуры сделает им предпочитаемый инструмент биологов и biophysicists для многочисленних будущих применений в науках о жизни на nanoscale, таким образом наводящ миры оптики и атомного разрешения под физиологопсихологическими условиями.

Справки

1. Линда Wildling, Барбара Unterauer, Rong Zhu, Энн Rupprecht, Томас Haselgrübler, Кристиан Rankl, Andreas Ebner, Дорис Vater, Philipp Pollheimer, Elena E. Pohl, Питер Hinterdorfer, и Hermann J. Gruber, «Соединять молекул датчика с амино группами к амино-functionalized AFM наклоняют,» Bioconjugate Chem 22 (2011): 1239-1248.
2. Джулиан Weghuber, Stefan Sunzenauer, Birgit Plochberger, Марио Brameshuber, Томас Haselgrübler, и Gerhard J. Schütz, «Височное разрешение взаимодействий протеина протеина в мембране плазмы в реальном маштабе времени-клетки,» Заднепроходное Bioanal Chem 397 (2010): 3339-3347.

О Технологиях Keysight

Keysight глобальные электронные технология и лидер рынка измерения помогая преобразовать опыт измерения своих клиентов через рационализаторство в беспроволочном, модульном, и программных решениях. Keysight обеспечивает электронные аппаратуры измерения и системы и родственное ПО, инструменты для конструирования ПО и обслуживания используемые в конструкции, развитии, изготовлении, установке, раскрытии и деятельности радиотехнической аппаратуры. Информация о Keysight доступна на www.keysight.com.

Источник: Технологии Keysight

Для больше информации на этом источнике пожалуйста посетите Технологии Keysight.

Date Added: May 17, 2012 | Updated: Dec 16, 2014

Last Update: 16. December 2014 12:31

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit