Fluorescence-Vägledd StyrkaSpektroskopi & Erkännande som Avbildar på Celler via ILM/AFM

Täckte Ämnen

Inledning
    FluorescenceMicroscopy i Bosatt CellAnalys
    Kombination av AFM-metoder med att Avbilda för FluorescenceErkännande
Överblick av Experiment
Glycosylphosphatidylinositol (GPI) Ankrade Grönt Fluorescerande Protein (GFP)
Molekylar som CD4 Fixeras med Gult Fluorescerande Protein (YFP)
Summariskt
Hänvisar till
Om Agilent Teknologier

Inledning

FluorescenceMicroscopy i Bosatt CellAnalys

Fluorescencemicroscopy har blivit ett viktigt bearbetar för att lokalisera receptor-/ligandväxelverkan i bosatt celler. När Du Märker olika proteiner med olika spektral- fluorophores låter att avbilda av olik cell-, subcellular eller molekylära delar och beslutsamhet av den specifika localizationen av proteinerna i celler. Kasseringen av oönskat, kort stavelse-våglängden bakgrund (den ljusa Rayleigh spridningen av magnetiseringen) vid spektral- filtrera förbättrar kontrasten av specifikt märkt cell- strukturerar i fluorescencemicroscopy. De sido- och axiella upplösningarna begränsas av diffractionen begränsar av ljust och resultat i ~200nm-upplösning. För en tid sedan har tekniker med högre upplösning framkallats, liksom uttömmning för stimulerat utsläpp (STED), foto-aktiverade localizationmicroscopy (PALM) och stochastic optisk rekonstruktionmicroscopy (STORM), som uppnår sidoupplösning av 10-30nm.

Kombination av AFM-metoder med att Avbilda för FluorescenceErkännande

Optiska tekniker, emellertid, kan inte ge någon information av ta provtopografin. Vid kontrast låter atom- styrka (AFM)microscopy topografisk avbildar för att erhållas på nanometerfjäll i vätskemiljöer och på rumstemperaturen. I tillägg parar erkännanden av receptoren/ligand kan utforskas på den jämna singel-molekylen.

En nyutvecklad samtidig topografi och erkännande som avbildar tekniken som utförs använda PicoTREC från Agilent Teknologier för arbetet som häri specificeras, är kapabel av eftergivent ett topografisk avbildar såväl som en kartlägga av erkännandeplatser av det samma området med en singelbildläsning på upplösning för lateralen 5nm. Den nya teknikens fungeringsprincip är samma som för dynamiskt avbilda för funktionslägeAFM. En cantilever svängs nära dess resonansfrekvens, och avläst över ta prov ytbehandla, men i detta fall göras cantileveren chemically känslig, genom att fästa en ligand via en kort linker till dess spets. De bindande platserna är tydliga från förminskningen av svängningsamplitud. Förhöjt signalera att bearbeta, i kombination med en ändrad återkoppling kretsar, ger en erkännande avbildar samtidigt fånget tillsammans med en topografi avbildar.

I grunden uppnås avskiljandet av topografiska och erkännandehändelser, genom att dela cantilever'sens svängningsamplituden in i lägre och övredelar (med hänsyn till cantilever'sens vila placera). Maximan av dessa delar är därefter det van vid rekordet topografin (lägre delar), och erkännande avbildar (övredelar) samtidigt.

Denna artikel diskuterar kapaciteten av Agilent 6000ILM det atom- styrkamikroskopet lätt att placera AFM-spetsen till regioner av intresserar genom att använda ettförhöjt optiskt avbildar, och en fluorescence avbildar, och de följande TRECNA som avbildar, och styrkaspektroskopin, som visar kickkorrelation bland fluorescencestyrka, bindande probability och erkännandeområde, såväl som visualizationen av de igenkända nanodomainsna på celler med olikt jämnar av proteinuttryck.

Överblick av Experiment

Ett av de mest fängslande ämnena i vetenskaperna om olika organismers beskaffenhet och bionanotechnology är utredningen av celler och organisationen och fungerar av proteiner i cellmembranet. Cellsignalerandet, kommunikationen till neighboring celler och transport till det närgränsande silkespappret organiseras all till och med membranproteiner. Två exempel av viktiga proteinsystem för cellsignalerande och organisation för cellmembran framläggas här.

AFM-experiment utfördes genom att använda en Agilent 6000ILM AFM som monterades på en Zeiss Axio Observatör A1 (för mätning av celler med GPI-GFP) eller ett KASSALÅDAPhotonicsfluorescence mikroskop (för mätning av celler med YFP-CD4). Allt avbildar ficks i PBS på rumstemperaturen genom att använda det Agilent MAC-Funktionsläget (dvs., magnetisk AC). Agilent typ VI och VII MAC Levers användes, och AFM avbildar ficks genom att använda Agilent PicoView programvara. Cantilevers för styrkaspektroskopi var influten chloroform tre tider, torkade luftar in, influten piranha (30% HO och22 70% HSO)2 för4 minut som 30 sköljas med, bevattna, och torkad, genom att värma på Cantilevers 100°C. för att avbilda för TREC, var influten chloroform tre tider, och torkat in lufta. Alla cantilevers behandlades med APTES, konjugerade med NHS--PEG-aldehyde eller NHS-FIXERA-acetal och anknöt därefter därpå med antikropp [1].

Glycosylphosphatidylinositol (GPI) Ankrade Grönt Fluorescerande Protein (GFP)

I plasmamembranet av celler finns det cholesterol, och sphingolipid-berikade områden som benämnas `-lipiden, rafts'. Serven för Dessa lipidrafts som uppläggning centrerar för enheten av signalerandemolekylar, påverkanmembranfluiditet och membranproteinmänniskohandeln och också påverkanreceptormänniskohandeln. Till exempel på specifikt starta, translocate membranreceptors liksom T-Cellen receptors eller B-Cell receptors in i lipidrafts, som är nödvändign för receptor-medlat effektivt signalerar transduction.

Den tillåtna Agilenten 6000ILM AFM utredningen av både morfologin och fördelningen av lipiden rafts på celler. För detta celler T24 (celler för människablåsacarcinoma) - som transfected till uttrycklig GPI ankrar härlett från DAF som fixerades till GFP [som benämndes GPI- (DAF) - GFP], en högt effektiv lipidraftmarkör [2] - var fullvuxet på exponeringsglas-botten Petri disk. Innan du avbildade fixades cellerna med 4% paraformaldehyde för minut 30.

Det topografisk avbildar (Figure1A) av cellerna erhölls genom att använda Agilent MAC-Funktionsläge. Den avbilda styrkan var, så stilla att glödtrådarna av cytoskeletonen under plasmamembranet kan knappt ses. Lamellipodia på cellen gränsar, emellertid kan klart avkännas. Det jämnt av GPI- (DAF) - GFP-uttryck i cellerna undersöktes, genom att erhålla GFP-fluorescence, avbildar (Figure1B).

Figurera 1. (A) AFM-topografi av fixade celler som T24 uttrycker GPI-GFP (avbilda storleksanpassar: 50μm). Avbilda mättes med MAC-Funktionsläge i PBS, genom att använda en MAC Lever som för Agilent typ VI svänger på 16kHz, och på 7nm med avbilda rusa omkring av 15μm/s. Den avbilda styrkan var, så stilla att glödtrådarna av cytoskeletonen under plasmamembranet kan knappt ses. Lamellipodia på cellen gränsar, emellertid kan klart avkännas. (B) Fluorescence avbildar (FITC filtrerar uppsättningen, förstoring för 100 x), av den samma cellvisningen uttryckt som är jämnt av GPI-GFP. Några ljusa regioner nucleusen indikerar nästan den endoplasmic reticulumen (ER), var deankrade proteinerna synthesizeds. Det okända ER-regionerna, fördelningen av GPI-GFP i plasmamembranet ser homogen, bortsett från flera ljusa pricker (e.g., de i det rött kvadrerar). (C) Genom att använda cantileveren functionalized med den anti-GFP antikroppen, avbildar erkännanden av regionen som markeras med det rött, kvadrerar i (B) avslöjda nanodomains med en storleksanpassa av omkring 200-300nm. I regionen som markeras med den streckade blåttet, cirkla, nanodomainsna har samlats, som korrelerar till microdomainen som visas i fluorescencen, avbildar väl. Under erkännanden som avbildar, svängde cantileveren, på 16 kHz, och på 7nm med avbilda rusa omkring av 6.5μm/s. Image storleksanpassar: 5μm.

Nästan är nucleusen av cellerna där några regioner med mycket kickfluorescencestyrka, som är i överensstämmelse med faktumet att deankrade proteinerna synthesizeds i den endoplasmic reticulumen som (ER) omger nucleusen av cellerna (se för att Figurera 2). Det okända ER-regionerna, där är ingen korrelation mellan den topografiska höjden och fluorescencestyrkan, som föreslår att mest av GPIEN- (DAF) - GFP-molekylar lokaliseras i plasmamembranet ganska än i cytosolen. Tillfälligt pricker någon ljus fluorescence kan finnas långt i väg från ER-regionen, som markerat med det rött kvadrera (Figure1B). Sådan ljust pricker kan vara vesiclen i cytosolen eller microdomain i plasmamembranet. I allmänhet visar den konventionella fluorescencemicroscopyen med den högsta förstoringen (100x) en homogen fördelning av GPI- (DAF) - GFP i plasmamembranet.

Figurera 2. Schematiskt diagram av den kombinerade optiska och atom- styrkamicroscopyen för erkännandemätningar på cellen. GPI-ankrad GFP synthesizeds i ER, ändras i Golgi och transporteras via vesicles till plasmamembranet. Fördriva det optiska mikroskopet kan undersöka det jämna total- uttryckt, och mikrometer-fjäll fördelning av GPI-GFP till och med fluorescencemätningen, erkännanden som avbildar vid antikropp-functionalizedcantileveren, kan visualisera fördelningen av GPI-GFP på nanometerfjäll. För erkännande som avbildar, svänger cantileveren, på konstant amplitud. När antikroppen på spetsrörorna med GFPEN på cellen ytbehandlar, vinkar övredelen av svängningen förminskas. Detta kan avkännas av Agilenten PicoTREC boxas, var svängningen vinkar delas in i övre- och lägre delar. Övredelen av svängningen vinkar är den van vid tankeskapelsen som erkännanden avbildar. Här visas erkännandehändelser i rött.

Att utforska fördelningen av GPI- (DAF) - GFP på nanometeren jämna, att avbilda för TREC användes. Principen av TREC som avbildar som använder en cantileverspets functionalized med den anti-GFP antikroppen, visas in Figurerar 2. Under att avbilda svänger cantileveren (drivande vid ett magnetiskt sätta in), på en konstant amplitud. När antikroppen på spetsrörorna med GFPEN på cellen ytbehandlar, förminskas övredelen av svängningen. Detta kan avkännas av Agilenten PicoTREC boxas, var svängningen vinkar delas in i övre- och lägre delar. Från övredelen av svängningen vinka, erkännanden avbildar kan konstrueras; området med en bindande händelse visas som en mörkerfläck.

Erkännanden avbildar av regionen som markeras med det rött, kvadrerar i Figure1B visas in Figurerar 1C. Från erkännanden avbilda, det kan ses att GPIEN- (DAF) - GFP-molekylar bildar nanodomains med en storleksanpassa av omkring 200-300nm. I regionen som markeras med den streckade blåttet, cirkla, nanodomainsna har samlats, som ser lik en microdomain i fluorescencen avbildar. En Sådan microdomain ger ett unikt överbryggar för att visa att korrelationen mellan fluorescencen och erkännanden avbildar.

Molekylar som CD4 Fixeras med Gult Fluorescerande Protein (YFP)

CD4 (samla i en klunga av differentiering 4), en glycoprotein som finnas ursprungligen på ytbehandla av T-hjälpredaceller, lekar en mycket viktig roll i immunologi och sjukdomen av HIV. Fördelningen av proteinet CD4 utforskades på celler T24 som transfected till uttrycklig YFP-fixerad CD4. Sådan celler fixades och avbildades, genom att använda fluorescencemicroscopy och AFM. Från brightfielden avbilda, och fluorescencen avbildar (Figurerar 3A och 3B), det fanns, att några av cellerna (e.g., cell 1 Figurerar in 3) har kickuttryck av YFP-CD4, fördriver några andra celler (e.g., cell 2 Figurerar in 3), har mycket lågt uttryck.

Figurera 3. (A) Brightfield avbildar, och avbildar fluorescence (B) av fixade celler T24 transfected med YFP-CD4 avslöjer, att några av cellerna (e.g., cell 1) har kickuttryck av YFP-CD4, fördriver några andra celler (e.g., cell 2) har mycket lågt uttryck. Med vägledningen av det optiskt avbildar, utfördes att avbilda för styrkaspektroskopi och för erkännande på cell 1 och cell 2. På cell 1, 244 styrka-distanserar buktar mättes, som 220 buktar från bindande händelser för show och att resultera i en bindande probability av 90,2%. (F-I) AFM-topografi och erkännande avbildar mätt på cell 1 och cell 2 med en MAC Lever för Agilent typ VII functionalized med antikroppen anti-CD4. Avbildar på de två cellerna mättes med den samma spetsen på den samma frekvensen (8kHz), och amplitud (om 50nm) med avbilda rusar av 1.9μm/s. Cellen 1 (panelH) visade omkring många stora erkännandefläckar med en storleksanpassa som spänner från 100 till 200nm, stundcell, 2 (panel Mig) visade mycket som mindre fläckar med mer ytterligare distanserar.

Med vägledningen av det optiskt avbildar, utfördes att avbilda för styrkaspektroskopi och för erkännande på celler 1 och 2. För dessa mätningar functionalized cantileverspetsarna med antikroppen anti-CD4. På cell 1, 244 styrka-distanserar buktar mättes, som 220 buktar från bindande händelser för show och att resultera i en bindande probability av 90,2% (Figurera 3D). Ett typisk styrka-distanserar buktar med en bindande händelse visas in Figurerar 3C. På cell 2, kraft 241 distanserar buktar mättes, som endast 10 buktar från bindande händelser för show och att resultera i en bindande probability av 4,1%. Ett typisk styrka-distanserar buktar utan en bindande händelse visas in Figurerar 3E. Styrka-distansera buktar mätningar på de två cellerna utfördes med den samma spetsen. Den Bindande probabilityen för cells1 och 2 är i mycket bra överenskommelse med fluorescencestyrkan.

Figurerar 3F till showen 3I AFM-topografin, och erkännande avbildar mätt på celler 1 och 2. Avbildar på dessa två celler mättes med den samma spetsen på den samma frekvensen och amplituden. Det fanns att det finns många stora erkännandefläckar på cell 1 (Figurera 3H) med en storleksanpassa som spänner från 100 till 200nm. Mest av erkännandefläckarna lokaliseras in spela golfboll i hål regioner i topografin, men erkännandefläckar kan också finnas i stickande fram regioner i topografin (Figurera 3F).

Många av nanodomainsna ar redan förbundna med varje annat. En Sådan kick - täthet av erkännandefläckar sammanträffar med den starka fluorescencen signalerar på cell 1 och är identisk med den bindande probabilityen för kicken från styrkaspektroskopin. Å andra sidan är erkännandefläckarna på cell 2 (Figurera 3I), normalt mindre än de på cell 1 och distansera mellan erkännandefläckar är i stort mer stor än det på cell 1. Det total- området av erkännandefläckar på cell 2 är mycket mindre, än det på cell 1, som korrelerar mycket väl till det jämnt för uttryck som avslöjs av fluorescencen, avbildar.

Att vidare undersöka noggrannheten av erkännandefläckarna, utfördes ett kvarterexperiment, genom att injicera den fria antikroppen anti-CD4 in i mätningslösningen. Figurera 4 visar att topografin av cellmembranet såg liknande efter kvarteret; emellertid förminskades erkännandefläckarna markant av den injicerade fria antikroppen. För att avbilda för och efter kvarteret användes den samma cantileveren på den samma svängningsfrekvensen och amplituden. Den klara förminskningen av erkännandefläckarna bekräftade noggrannheten av deavslöjda nanodomainsna CD4.

Figurera 4. (A) Topografi och erkännande (B) avbildar på fixade celler som T24 uttrycker YFP-CD4 för kvarteret som avbildas av Mac Lever för Agilent typ VII functionalized med antikroppen anti-CD4. Omkring 2,5 timmar efter injektionen av fria molekylar för antikroppen anti-CD4 (med en finalkoncentration av 0.05mg/ml), topografi (C) och erkännande (D) avbildar mättes på samma placerar med den samma cantileverspetsen, som visade viktig förminskning av erkännandefläckar. Allt avbildar mättes på en cantileversvängningsfrekvens av 8.37kHz, en amplitud av omkring 50nm, och med avbilda rusa av omkring 2.7μm/s.

Summariskt

Den fullständigt inbyggda kombinationen av det atom- styrkamikroskopet och inverterade ljusa mikroskopkapaciteter som hades råd med av Agilenten 6000ILM AFM möjliggjorde för en tid sedan, en lätt och snabb utredning av fördelningen av proteiner för cellmembranet på mikrometer- och nanometerfjällen. Den enkla och lämpliga funktionen av detta nytt instrumenterar ska gör det som föredras för att bearbeta av biologer, och biophysicists för talrika framtida applikationer i vetenskaperna om olika organismers beskaffenhet på nanoscalen och därmed att överbrygga världarna av optik och atom- upplösning under fysiologiskt villkorar.

Hänvisar till

1. Linda Wildling, Barbara Unterauer, Rong Zhu, Anne Rupprecht, Thomas Haselgrübler, Kristen Rankl, Andreas Ebner, Doris Vater, Philipp Pollheimer, Elena E. Pohl, Peter Hinterdorfer och Hermann J. Gruber, ”att Anknyta av avkännaremolekylar med amino grupper till amino-functionalized AFM tippar,” Bioconjugate Chem 22 (2011): 1239-1248.
2. Julian Weghuber, Stefan Sunzenauer, Birgit Plochberger, Mario Brameshuber, Thomas Haselgrübler och Gerhard J. Schütz, ”Temporal upplösning av proteinproteinväxelverkan i detcell plasmamembranet,” Anala Bioanal Chem 397 (2010): 3339-3347.

Om Agilent Teknologier

nanotechnology instrumenterar l5At dig avbilda, behandla och karakterisera en bred variation av nanoscaleuppföranden - som är elektriska som är kemiska som är biologiska som är molekylära och som är atom-. Vår växande samling av nanotechnology instrumenterar, tillbehör, programvara, servar, och förbrukningsmaterialer kan avslöja ledtrådar som du behöver att förstå nanoscalevärlden.

Agilent Teknologier erbjuder att en lång räcka av kick-precision atom- styrkamikroskop (AFM) ska möta dina unika forskningbehov. Högt configurable Agilents instrumenterar låter dig utvidga systemets kapaciteter, som dina behov uppstår. Agilents möjliggör bransch-ledande miljötemperatursystem och fluid bruk överlägsen flytande och mjukt avbilda för material. Applikationer inkluderar materiell vetenskap, electrochemistry, polymern och vetenskaperna om olika organismers beskaffenhetapplikationer.

Date Added: May 17, 2012 | Updated: Jul 15, 2013

Last Update: 15. July 2013 16:40

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit