荧光引导的强制分光学 & 识别想象在细胞通过 ILM/AFM

包括的事宜

简介
    在活细胞分析的荧光显微法
    结合 AFM 方法与荧光识别想象
实验概览
Glycosylphosphatidylinositol (GPI) 停住的绿色萤光蛋白质 (GFP)
CD4 分子熔化与黄色萤光蛋白质 (YFP)
汇总
参考
关于 Agilent 技术

简介

在活细胞分析的荧光显微法

荧光显微法成为为局限化感受器官/配合基交往的一个重要工具在活细胞。 标记不同的用不同的光谱 fluorophores 的蛋白质允许不同的蛋白质的特定本地化的蜂窝电话,亚细胞或者分子要素和确定想象在细胞的。 不需要,短波背景 (励磁光瑞利散射的拒绝) 通过光谱过滤改进在荧光显微法的特别地被标记的蜂窝电话结构对比。 侧向和轴向解决方法由光和结果衍射极限限制在 ~200nm 解决方法。 最近,与更加高分辨率的技术被开发了,例如受激发射取尽 (STED),照片激活了本地化显微学 (PALM)和随机光学重建显微学 (风暴),达到 10-30nm 的侧向解决方法。

结合 AFM 方法与荧光识别想象

光学技术,然而,不可能范例地势的任何情报。 相反,基本强制显微学 (AFM)在液体环境里允许地形学图象得到在毫微米缩放比例和在室温。 另外,感受器官/配合基对的识别可以调查在单一分子级别。

最近被开发的同时地势和识别成象技术,执行使用从 Agilent 技术的 PicoTREC 为此中详述的这个工作,能够产生一个地形学图象以及同一区的识别位点映射与唯一扫描的在 5nm 侧面解决方法。 新的技术的操作原理是同一样动态模式 AFM 想象的。 悬臂在其共鸣频率附近摆动并且浏览在范例表面,但是悬臂通过附有配合基在这种情况下使化工敏感通过一个短的连接器其技巧。 束缚位置从动摆高度的减少是明显的。 改进的信号处理,与一个被修改的反馈环路的组合,提供沿着地势图象同时获取的识别图象。

本质上,地形学和识别活动的分隔通过分裂悬臂的动摆高度达到到更低和上部 (关于悬臂的静止位置)。 这些零件最大数量然后用于同时记录地势 (低部) 和识别图象 (上部)。

此条款讨论 Agilent 6000ILM 基本强制显微镜的能力容易地确定 AFM 技巧对地区利益使用一个对比改进的光学图象和荧光图象和随后的 TREC 想象和强制分光学,显示在荧光强度中的高相关性、约束概率和识别区,以及被认可的 nanodomains 的形象化在用蛋白质表达式的不同的级别的细胞。

实验概览

其中一最迷人的事宜在生命科学和 bionanotechnology 是细胞和这个组织的蛋白质的调查和功能在细胞膜的。 细胞信号、通信对相邻的细胞和运输对相邻组织通过膜蛋白质所有被组织。 存在得重要蛋白质系统的二个示例细胞信号和细胞膜组织的这里。

AFM 实验执行使用在直到 Photonicsfluorescence 显微镜的蔡司 Axio 观察员 6000ILM AFM 挂接的 Agilent A1 (为细胞的评定与 GPI-GFP) 或 a (为细胞的评定与 YFP-CD4 的)。 使用 Agilent MAC 模式 (即,磁性 AC),所有图象在室温的 PBS 获取了。 MAC 杠杆使用 Agilent 类型 VI 和 VII 使用 Agilent PicoView 软件,并且 AFM 图象获取了。 强制分光学的悬臂在三氯甲烷被洗涤了三次,烘干在航空,洗涤在比拉鱼 (30% HO 和22 70% HSO)24 30 分钟,漂洗用水,并且烘干通过加热在 100°C. TREC 想象的悬臂在三氯甲烷在航空被洗涤了三次并且被烘干了。 所有悬臂对待与 APTES,然后共轭了与 NHS-PEG- 醋醛或 NHS 钉缩醛和与抗体 [1] 随后链接了。

Glycosylphosphatidylinositol (GPI) 停住的绿色萤光蛋白质 (GFP)

在细胞的质膜,有胆固醇,并且 sphingolipid 被丰富的域,被命名 ` 油脂漂流’。 这些油脂木筏起组织的中心作用对于交易信号分子的装配,影响膜流动性和膜蛋白质,并且影响感受器官交易。 例如,在特定触发,膜感受器官例如 T 细胞感受器官或 B 细胞感受器官改变的位置到油脂木筏,是前提对于高效的感受器官斡旋的信号换能。

Agilent 6000ILM AFM 允许形态学和油脂木筏的配电器的调查在细胞的。 对此, T24 transfected 表示从 DAF 派生的 GPI 锚点被熔化到 GFP 的细胞 (人力膀胱癌细胞) - [被命名 GPI- (DAF) - GFP],一个高效的油脂木筏标记 [2] - 在玻璃底层培养皿增长。 在想象前,细胞修理了与 4% 多聚甲醛 30 Min。

地形学图象 (Figure1A) 使用 Agilent MAC 模式的细胞得到了。 想象强制是很柔和的细胞骨架的细丝在质膜下的能几乎被看见。 可以明显地检测在细胞边界的 Lamellipodia,然而。 GPI- (DAF) 的级别 - 在细胞的 GFP 表达式通过得到 GFP 荧光图象检查 (Figure1B)。

图 1. (a) 表示固定的 T24 的细胞 AFM 地势 GPI-GFP (图象范围: 50μm)。 这个图象评定了在 PBS 的 MAC 模式下通过使用 Agilent 类型 VI 大约摆动在 16kHz 和在与 15μm/s. 的想象速度的 7nm 的 MAC 杠杆。 想象强制是很柔和的细胞骨架的细丝在质膜下的能几乎被看见。 可以明显地检测在细胞边界的 Lamellipodia,然而。 (b) 荧光图象 (FITC 补白集, 100 个 x 放大显示 GPI-GFP 的表达式级别) 的同样细胞。 接近中坚力量的一些明亮的地区指示内质网 (ER), GPI 停住的蛋白质被综合。 在 ER 地区之外, GPI-GFP 的配电器在质膜的看起来同类,除了几个明亮的小点 (即,那些在红场)。 (c) 通过使用悬臂 functionalized 与反GFP 抗体,这个区域的识别图象标记用在 (b) 的红场显示了与 200-300nm 的大约范围的 nanodomains。 在这个区域标记用该死的蓝色圈子, nanodomains 被综合了,与在荧光图象显示的 microdomain 很好关联。 在识别想象期间,悬臂大约摆动在 16 kHz 和在与 6.5μm/s. 图象范围的想象速度的 7nm : 5μm.

接近细胞的中坚力量有与非常高荧光强度的有些地区,是与这个情况符合 GPI 停住的蛋白质在包围细胞的 (ER)中坚力量的内质网被综合 (参见图 2)。 在 ER 地区之外,没有这个地形学高度和荧光强度之间的相关性,建议大多数 GPI- (DAF) - GFP 分子位于质膜而不是在原生质。 偶然地,一些明亮的荧光小点可以很远从 ER 区域被找到,如标记用红场 (Figure1B)。 这样明亮的小点可能是在原生质的在质膜的泡或 microdomain。 一般来说,与最高的放大 (100x) 的常规荧光显微法显示 GPI- (DAF) - 在质膜的 GFP 的一个同类的配电器。

在细胞的图 2. 简图联合的光学和基本强制显微学识别评定的。 GPI 停住的 GFP 在 ER 被综合,在 Golgi 被修改,并且通过对质膜的泡被运输。 当光学显微镜可能通过荧光评定时检查 GPI-GFP 的整体表达式级别和测微表缩放比例配电器,由抗体functionalized 悬臂的识别想象可能形象化 GPI-GFP 的配电器在毫微米缩放比例。 对识别想象,悬臂摆动在恒定的高度。 当在这个技巧的抗体束缚与在细胞表面时的 GFP,减少动摆通知的上部。 这可以由 Agilent PicoTREC 配件箱检测,动摆通知被分裂成上面和低部。 动摆通知的上部用于修建识别图象。 这里,识别活动在红色显示。

要调查 GPI- (DAF) - 在毫微米级别的 GFP 的配电器, TREC 想象使用。 TREC 想象的原则使用一个悬臂式技巧的 functionalized 与反GFP 抗体在表 2. 显示。 在想象期间,悬臂摆动 (驱动由一个磁场) 在一个恒定的高度。 当在这个技巧的抗体束缚与在细胞表面时的 GFP,减少动摆的上部。 这可以由 Agilent PicoTREC 配件箱检测,动摆通知被分裂成上面和低部。 从动摆通知的上部,识别图象可以被修建; 与一个约束活动的区显示作为一个黑点。

这个区域的识别图象标记用在 Figure1B 的红场在图 1C 显示。 从识别图象,能被看见 GPI- (DAF) - GFP 分子形成与 200-300nm 的大约范围的 nanodomains。 在这个区域标记用该死的蓝色圈子, nanodomains 被综合了,看起来象在荧光图象的一 microdomain。 这样 microdomain 提供一座唯一桥梁显示荧光和识别图象之间的相关性。

CD4 分子熔化与黄色萤光蛋白质 (YFP)

CD4 (分化 4) 字符串,在 T 协助细胞表面原来地找到的糖蛋白,作用非常重要作用在免疫学方面和 HIV 疾病。 CD4 蛋白质的配电器在 T24 transfected 表示 YFP 被熔化的 CD4 的细胞调查。 这样细胞是固定和印象的通过使用荧光显微法和 AFM。 从 brightfield 图象和荧光图象 (图 3A 和 3B),发现了某些细胞 (即,细胞 1 在表 3) 有 YFP-CD4 高表达式,而一些其他细胞 (即,细胞 2 在表 3) 有非常低表达式。

图 3. (a) Brightfield 图象和 (b) 固定的 T24 细胞荧光图象 transfected 与 YFP-CD4 表示某些细胞 (即,细胞 1) 有 YFP-CD4 高表达式,而一些其他细胞 (即,细胞 2) 有非常低表达式。 光学图象的指导,强制分光学和识别想象在细胞 1 和细胞 2. 执行。 在细胞 1, 244 强制距离曲线被评定了, 220 个曲线显示约束活动,造成一个约束概率 90.2%。 (F-I) AFM 在与 Agilent 类型 VII MAC 杠杆的细胞 1 和细胞评定的地势和识别图象 2 functionalized 与反CD4 抗体。 在二个细胞的图象评定了与在相同频率 (8kHz) 和高度的同一个技巧 (关于 50nm) 与 1.9μm/s. 细胞 1 的大约想象速度 (面板 H) 显示了与范围从 100 的范围的许多大识别地点到 200nm,而细胞 2 (面板 I) 显示了与更更的距离的更小的地点。

光学图象的指导,强制分光学和识别想象在细胞 1 和 2. 执行。 对于这些评定,悬臂式技巧 functionalized 与反CD4 抗体。 在细胞 1, 244 强制距离曲线被评定了, 220 个曲线显示约束活动,造成一个约束概率 90.2% (图 3D)。 与一个约束活动的典型的强制距离曲线在图 3C 显示。 在细胞 2, 241 强制距离曲线被评定了,仅 10 个曲线显示约束活动,造成一个约束概率 4.1%。 没有一个约束活动的典型的强制距离曲线在图 3E 显示。 在二个细胞的强制距离曲线评定进行了与同一个技巧。 cells1 和 2 的约束概率在非常与荧光强度的利益协定。

对 3I 显示的图 3F 被评定的 AFM 地势和识别图象在细胞 1 和 2. 图象在这两个细胞评定了与在相同频率和高度的同一个技巧。 发现有在细胞 1 (图 3H) 的许多大识别地点与范围从 100 的范围到 200nm。 大多识别地点在地势里位于漏洞地区,但是识别地点在地势 (图 3F) 里可能在推出的地区也找到。

许多 nanodomains 彼此已经连接。 这样高密识别地点与在细胞 1 的严格的荧光信号相符,并且是完全相同和从强制分光学的高约束概率。 另一方面,在细胞 2 (图 3I) 的识别地点小于那些在细胞 1 和识别地点之间的距离比那通常基本上极大在细胞 1。 识别地点整体区在细胞 2 的比那是较少在细胞 1,与荧光图象显示的表达式级别很好关联。

进一步检查识别地点的特异性,块实验通过注射自由反CD4 抗体执行到评定解决方法。 图 4 向显示细胞膜的地势看起来类似在这个块以后; 然而,被注射的自由抗体显著减少识别地点。 对想象,在这个块,同一个悬臂使用了在同一个动摆频率和高度前后。 识别地点的清楚的减少确认了识别想象显示的 CD4 nanodomains 的特异性。

在固定的 T24 细胞的图 4. (a) 地势和 (b) 识别图象表示 YFP-CD4 在块前,印象由 Agilent 类型 VII Mac 杠杆 functionalized 与反CD4 抗体。 大约 2.5 时数在自由反CD4 抗体分子 (与最终浓度 0.05mg/ml), (c) 地势和 (d) 识别图象的射入以后被评定了在与同一个悬臂式技巧的同一个位置,显示识别地点的重大的减少。 所有图象大约被评定了以 8.37kHz 一个悬臂式动摆频率,高度 50nm 和与 2.7μm/s. 的大约想象速度。

汇总

基本强制显微镜和被倒置的 Agilent 提供的光学显微镜功能的充分地集成组合 6000ILM AFM 最近启用了细胞膜蛋白质的配电器的一个容易和快速调查在测微表和毫微米缩放比例。 此新的仪器的简单和方便运算在生命科学将做它最适合的工具生物学家和生物物理学家为许多将来的应用在 nanoscale,从而跨接光学和基本解决方法世界在生理情况下。

参考

1. 琳达 Wildling,巴巴拉 Unterauer, Rong 朱,安妮 Rupprecht,托马斯 Haselgrübler,基督徒 Rankl、安德烈亚斯 Ebner, Doris Vater, Philipp Pollheimer,埃琳娜 E. Pohl,彼得 Hinterdorfer 和 Hermann J. Gruber, “链接传感器分子与对氨基functionalized AFM 的氨基打翻”, Bioconjugate Chem 22日 (2011) : 1239-1248.
2. 朱利安 Weghuber、斯蒂芬 Sunzenauer,比伊特 Plochberger,马力欧 Brameshuber,托马斯 Haselgrübler 和格哈德 J. Schutzz, “蛋白质在活细胞质膜的蛋白质交往的时间分辨率”,肛门 Bioanal Chem 397 (2010) : 3339-3347.

关于 Agilent 技术

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Date Added: May 17, 2012 | Updated: Jul 15, 2013

Last Update: 15. July 2013 15:46

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