熒光引導的強制分光學 & 識別想像在細胞通過 ILM/AFM

主辦由 Keysight 技術

包括的事宜

簡介
    在活細胞分析的熒光顯微法
    結合 AFM 方法與熒光識別想像
實驗概覽
Glycosylphosphatidylinositol (GPI) 停住的綠色螢光蛋白質 (GFP)
CD4 分子熔化與黃色螢光蛋白質 (YFP)
彙總
參考
關於 Keysight 技術

簡介

在活細胞分析的熒光顯微法

熒光顯微法成為為局限化感受器官/配合基交往的一個重要工具在活細胞。 標記不同的用不同的光譜 fluorophores 的蛋白質允許不同的蛋白質的特定本地化的蜂窩電話,亞細胞或者分子要素和確定想像在細胞的。 不需要,短波背景 (勵磁光瑞利散射的拒绝) 通過光譜過濾改進在熒光顯微法的特別地被標記的蜂窩電話結構對比。 側向和軸向解決方法由光和結果衍射極限限制在 ~200nm 解決方法。 最近,與更加高分辨率的技術被開發了,例如受激發射取盡 (STED),照片激活了本地化顯微學 (PALM)和隨機光學重建顯微學 (風暴),達到 10-30nm 的側向解決方法。

結合 AFM 方法與熒光識別想像

光學技術,然而,不可能範例地勢的任何情報。 相反,基本強制顯微學 (AFM)在液體環境裡允許地形學圖像得到在毫微米縮放比例和在室溫。 另外,感受器官/配合基對的識別可以調查在單一分子級別。

最近被開發的同時地勢和識別成像技術,執行使用從 Keysight 技術的 PicoTREC 為此中詳述的這個工作,能够產生一個地形學圖像以及同一區的識別位點映射與唯一掃描的在 5nm 側面解決方法。 新的技術的操作原理是同一樣動態模式 AFM 想像的。 懸臂在其共鳴頻率附近擺動并且瀏覽在範例表面,但是懸臂通過附有配合基在這種情況下使化工敏感通過一個短的連接器其技巧。 束縛位置從動擺高度的減少是明顯的。 改進的信號處理,與一個被修改的反饋環路的組合,提供沿著地勢圖像同時獲取的識別圖像。

本質上,地形學和識別活動的分隔通過分裂懸臂的動擺高度達到到更低和上部 (關於懸臂的靜止位置)。 這些零件最大數量然後用於同時記錄地勢 (低部) 和識別圖像 (上部)。

此條款討論 Keysight 6000ILM 基本強制顯微鏡的能力容易地確定 AFM 技巧對地區利益使用一個對比改進的光學圖像和熒光圖像和隨後的 TREC 想像和強制分光學,顯示在熒光強度中的高相關性、約束概率和識別區,以及被認可的 nanodomains 的形象化在用蛋白質表達式的不同的級別的細胞。

實驗概覽

其中一最迷人的事宜在生命科學和 bionanotechnology 是細胞和這個組織的蛋白質的調查和功能在細胞膜的。 細胞信號、通信對相鄰的細胞和運輸對相鄰組織通過膜蛋白質所有被組織。 存在得重要蛋白質系統的二個示例細胞信號和細胞膜組織的這裡。

AFM 實驗執行使用在直到 Photonicsfluorescence 顯微鏡的蔡司 Axio 觀察員 6000ILM AFM 掛接的 Keysight A1 (為細胞的評定與 GPI-GFP) 或 a (為細胞的評定與 YFP-CD4 的)。 使用 Keysight MAC 模式 (即,磁性 AC),所有圖像在室溫的 PBS 獲取了。 MAC 槓桿使用 Keysight 類型 VI 和 VII 使用 Keysight PicoView 軟件,并且 AFM 圖像獲取了。 強制分光學的懸臂在三氯甲烷被洗滌了三次,烘乾在航空,洗滌在比拉魚 (30% HO 和22 70% HSO)24 30 分鐘,漂洗用水,并且烘乾通過加熱在 100°C. TREC 想像的懸臂在三氯甲烷在航空被洗滌了三次并且被烘乾了。 所有懸臂對待與 APTES,然後共軛了與 NHS-PEG- 醋醛或 NHS 釘縮醛和與抗體 [1] 隨後鏈接了。

Glycosylphosphatidylinositol (GPI) 停住的綠色螢光蛋白質 (GFP)

在細胞的質膜,有膽固醇,并且 sphingolipid 被豐富的域,被命名 ` 油脂漂流』。 這些油脂木筏起組織的中心作用對於交易信號分子的裝配,影響膜流動性和膜蛋白質,並且影響感受器官交易。 例如,在特定觸發,膜感受器官例如 T 細胞感受器官或 B 細胞感受器官改變的位置到油脂木筏,是前提對於高效的感受器官斡旋的信號換能。

Keysight 6000ILM AFM 允許形態學和油脂木筏的配電器的調查在細胞的。 对此, T24 transfected 表示從 DAF 派生的 GPI 錨點被熔化到 GFP 的細胞 (人力膀胱癌細胞) - [被命名 GPI- (DAF) - GFP],一個高效的油脂木筏標記 [2] - 在玻璃底層培養皿增長。 在想像前,細胞修理了與 4% 多聚甲醛 30 Min。

地形學圖像 (Figure1A) 使用 Keysight MAC 模式的細胞得到了。 想像強制是很柔和的細胞骨架的細絲在質膜下的能幾乎被看見。 可以明顯地檢測在細胞邊界的 Lamellipodia,然而。 GPI- (DAF) 的級別 - 在細胞的 GFP 表達式通過得到 GFP 熒光圖像檢查 (Figure1B)。

圖 1. (a) 表示固定的 T24 的細胞 AFM 地勢 GPI-GFP (圖像範圍: 50μm)。 這個圖像評定了在 PBS 的 MAC 模式下通過使用 Keysight 類型 VI 大約擺動在 16kHz 和在與 15μm/s. 的想像速度的 7nm 的 MAC 槓桿。 想像強制是很柔和的細胞骨架的細絲在質膜下的能幾乎被看見。 可以明顯地檢測在細胞邊界的 Lamellipodia,然而。 (b) 熒光圖像 (FITC 補白集, 100 个 x 放大顯示 GPI-GFP 的表達式級別) 的同樣細胞。 接近中堅力量的一些明亮的地區指示內質網 (ER), GPI 停住的蛋白質被綜合。 在 ER 地區之外, GPI-GFP 的配電器在質膜的看起來同類,除了幾個明亮的小點 (即,那些在紅場)。 (c) 通過使用懸臂 functionalized 與反GFP 抗體,這個區域的識別圖像標記用在 (b) 的紅場顯示了與 200-300nm 的大約範圍的 nanodomains。 在這個區域標記用該死的藍色圈子, nanodomains 被綜合了,與在熒光圖像顯示的 microdomain 很好關聯。 在識別想像期間,懸臂大約擺動在 16 kHz 和在與 6.5μm/s. 圖像範圍的想像速度的 7nm : 5μm.

接近細胞的中堅力量有與非常高熒光強度的有些地區,是與這個情況符合 GPI 停住的蛋白質在包圍細胞的 (ER)中堅力量的內質網被綜合 (參見圖 2)。 在 ER 地區之外,沒有這個地形學高度和熒光強度之間的相關性,建議大多數 GPI- (DAF) - GFP 分子位於質膜而不是在原生質。 偶然地,一些明亮的熒光小點可以很遠從 ER 區域被找到,如標記用紅場 (Figure1B)。 這樣明亮的小點可能是在原生質的在質膜的泡或 microdomain。 一般來說,與最高的放大 (100x) 的常規熒光顯微法顯示 GPI- (DAF) - 在質膜的 GFP 的一個同類的配電器。

在細胞的圖 2. 簡圖聯合的光學和基本強制顯微學識別評定的。 GPI 停住的 GFP 在 ER 被綜合,在 Golgi 被修改,并且通過對質膜的泡被運輸。 當光學顯微鏡可能通過熒光評定時檢查 GPI-GFP 的整體表達式級別和測微表縮放比例配電器,由抗體functionalized 懸臂的識別想像可能形象化 GPI-GFP 的配電器在毫微米縮放比例。 对識別想像,懸臂擺動在恆定的高度。 當在這個技巧的抗體束縛與在細胞表面時的 GFP,減少動擺通知的上部。 這可以由 Keysight PicoTREC 配件箱檢測,動擺通知被分裂成上面和低部。 動擺通知的上部用於修建識別圖像。 這裡,識別活動在紅色顯示。

要調查 GPI- (DAF) - 在毫微米級別的 GFP 的配電器, TREC 想像使用。 TREC 想像的原則使用一個懸臂式技巧的 functionalized 與反GFP 抗體在表 2. 顯示。 在想像期間,懸臂擺動 (驅動由一個磁場) 在一個恆定的高度。 當在這個技巧的抗體束縛與在細胞表面時的 GFP,減少動擺的上部。 這可以由 Keysight PicoTREC 配件箱檢測,動擺通知被分裂成上面和低部。 從動擺通知的上部,識別圖像可以被修建; 與一個約束活動的區顯示作為一個黑點。

這個區域的識別圖像標記用在 Figure1B 的紅場在圖 1C 顯示。 從識別圖像,能被看見 GPI- (DAF) - GFP 分子形成與 200-300nm 的大約範圍的 nanodomains。 在這個區域標記用該死的藍色圈子, nanodomains 被綜合了,看起來像在熒光圖像的一 microdomain。 這樣 microdomain 提供一座唯一橋梁顯示熒光和識別圖像之間的相關性。

CD4 分子熔化與黃色螢光蛋白質 (YFP)

CD4 (分化 4) 字符串,在 T 協助細胞表面原來地找到的糖蛋白,作用非常重要作用在免疫學方面和 HIV 疾病。 CD4 蛋白質的配電器在 T24 transfected 表示 YFP 被熔化的 CD4 的細胞調查。 這樣細胞是固定和印象的通過使用熒光顯微法和 AFM。 從 brightfield 圖像和熒光圖像 (圖 3A 和 3B),發現了某些細胞 (即,細胞 1 在表 3) 有 YFP-CD4 高表達式,而一些其他細胞 (即,細胞 2 在表 3) 有非常低表達式。

圖 3. (a) Brightfield 圖像和 (b) 固定的 T24 細胞熒光圖像 transfected 與 YFP-CD4 表示某些細胞 (即,細胞 1) 有 YFP-CD4 高表達式,而一些其他細胞 (即,細胞 2) 有非常低表達式。 光學圖像的指導,強制分光學和識別想像在細胞 1 和細胞 2. 執行。 在細胞 1, 244 強制距離曲線被評定了, 220 個曲線顯示約束活動,造成一個約束概率 90.2%。 (F-I) AFM 在與 Keysight 類型 VII MAC 槓桿的細胞 1 和細胞評定的地勢和識別圖像 2 functionalized 與反CD4 抗體。 在二個細胞的圖像評定了與在相同頻率 (8kHz) 和高度的同一個技巧 (關於 50nm) 與 1.9μm/s. 細胞 1 的大約想像速度 (面板 H) 顯示了與範圍從 100 的範圍的許多大識別地點到 200nm,而細胞 2 (面板 I) 顯示了與更更的距離的更小的地點。

光學圖像的指導,強制分光學和識別想像在細胞 1 和 2. 執行。 對於這些評定,懸臂式技巧 functionalized 與反CD4 抗體。 在細胞 1, 244 強制距離曲線被評定了, 220 個曲線顯示約束活動,造成一個約束概率 90.2% (圖 3D)。 與一個約束活動的典型的強制距離曲線在圖 3C 顯示。 在細胞 2, 241 強制距離曲線被評定了,仅 10 個曲線顯示約束活動,造成一個約束概率 4.1%。 沒有一個約束活動的典型的強制距離曲線在圖 3E 顯示。 在二個細胞的強制距離曲線評定進行了與同一個技巧。 cells1 和 2 的約束概率在非常與熒光強度的利益協定。

對 3I 顯示的圖 3F 被評定的 AFM 地勢和識別圖像在細胞 1 和 2. 圖像在這兩個細胞評定了與在相同頻率和高度的同一個技巧。 發現有在細胞 1 (圖 3H) 的許多大識別地點與範圍從 100 的範圍到 200nm。 大多識別地點在地勢裡位於漏洞地區,但是識別地點在地勢 (圖 3F) 裡可能在推出的地區也找到。

許多 nanodomains 彼此已經連接。 這樣高密識別地點與在細胞 1 的嚴格的熒光信號相符,并且是完全相同和從強制分光學的高約束概率。 另一方面,在細胞 2 (圖 3I) 的識別地點小於那些在細胞 1 和識別地點之間的距離比那通常基本上極大在細胞 1。 識別地點整體區在細胞 2 的比那是較少在細胞 1,與熒光圖像顯示的表達式級別很好關聯。

進一步檢查識別地點的特異性,塊實驗通過注射自由反CD4 抗體執行到評定解決方法。 圖 4 向顯示細胞膜的地勢看起來類似在這個塊以後; 然而,被注射的自由抗體顯著減少識別地點。 对想像,在這個塊,同一個懸臂使用了在同一個動擺頻率和高度前後。 識別地點的清楚的減少確認了識別想像顯示的 CD4 nanodomains 的特異性。

在固定的 T24 細胞的圖 4. (a) 地勢和 (b) 識別圖像表示 YFP-CD4 在塊前,印象由 Keysight 類型 VII Mac 槓桿 functionalized 與反CD4 抗體。 大約 2.5 時數在自由反CD4 抗體分子 (與最終濃度 0.05mg/ml), (c) 地勢和 (d) 識別圖像的射入以後被評定了在與同一個懸臂式技巧的同一個位置,顯示識別地點的重大的減少。 所有圖像大約被評定了以 8.37kHz 一個懸臂式動擺頻率,高度 50nm 和與 2.7μm/s. 的大約想像速度。

彙總

基本強制顯微鏡和被倒置的 Keysight 提供的光學顯微鏡功能的充分地集成組合 6000ILM AFM 最近啟用了細胞膜蛋白質的配電器的一個容易和快速調查在測微表和毫微米縮放比例。 此新的儀器的簡單和方便運算在生命科學將做它最適合的工具生物學家和生物物理學家為許多將來的應用在 nanoscale,從而跨接光學和基本解決方法世界在生理情況下。

參考

1. 琳達 Wildling,巴巴拉 Unterauer, Rong 朱,安妮 Rupprecht,托馬斯 Haselgrübler,基督徒 Rankl、安德烈亞斯 Ebner, Doris Vater, Philipp Pollheimer,埃琳娜 E. Pohl,彼得 Hinterdorfer 和 Hermann J. Gruber, 「鏈接傳感器分子與對氨基functionalized AFM 的氨基打翻」, Bioconjugate Chem 22日 (2011) : 1239-1248.
2. 朱利安 Weghuber、斯蒂芬 Sunzenauer,比伊特 Plochberger,馬力歐 Brameshuber,托馬斯 Haselgrübler 和格哈德 J. Schutzz, 「蛋白質在活細胞質膜的蛋白質交往的時間分辨率」,肛門 Bioanal Chem 397 (2010) : 3339-3347.

關於 Keysight 技術

Keysight 是幫助一個全球電子評定技術和的市場帶頭人通過在無線,模件和軟件解決方法的創新變換其客戶的評定經驗。 Keysight 提供電子評定用於電子設備的設計、發展、製造、安裝、配置和運算和相關軟件,軟件設計工具和服務的儀器和系統。 關於 Keysight 的信息是可用的在 www.keysight.com

來源: Keysight 技術

關於此來源的更多信息请請參觀 Keysight 技術

Date Added: May 17, 2012 | Updated: Dec 16, 2014

Last Update: 16. December 2014 12:29

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit