AtomKraft-Mikroskopie: Quantitative Darstellung von Lebenden Biologischen Proben unter Verwendung PeakForce QNM

Durch AZoNano

Inhaltsverzeichnis

Einleitung
FLUGHANDBUCH- und ZellMechaniker
Einfache, Hochauflösende Quantifikation von BeispielMechanischen Eigenschaften
Direkte Quantifikation von FLUGHANDBUCH-Signalen auf Biologischen Proben
Darstellung Biologische Proben mit PeakForce QNM
Überwachung ZellDynamik in der Istzeit
BedeckungsFLUGHANDBUCH und Optische Kanäle
Schlussfolgerung
Über Bruker

Einleitung

Es ist ein wohl bekannte Tatsache, dass die Bestimmung der mechanischen Eigenschaften der lebenden Zellen die Gesundheit des Organismus ex vivo anzeigen kann, von der sie extrahiert wurden. Besonders im Kraftmodus, ist FLUGHANDBUCH ein leistungsfähiges Diagnose- und Untersuchungshilfsmittel. Kraftspektroskopie hat viele Nachteile wie weniger Auflösung, Drehzahl der Datenerfassung, und sie liefert nicht die erforderlichen quantitativen Informationen. PeakForce QNM ist durch Bruker entwickelt worden, um informative Daten an der hohen Auflösung mit bemerkenswerter Benutzerfreundlichkeit anzubieten.

FLUGHANDBUCH- und ZellMechaniker

Seit seiner Entwicklung ist FLUGHANDBUCH ein Hilfsmittel der Wahl zu den super weichen biologischen Proben des Bildes, besonders mit dem Auftauchen von Spektroskopie TappingMode™ und der Kraft und von Tatsache, dass es eine der wenigen Mikroskopietechniken ist, die Beobachtung von Zellen unter fast-physiologischen Bedingungen erlaubt. FLUGHANDBUCH ist häufig benutzt, elastisches Verhalten und Zellsystemumstellung oder -abteilung aufeinander zu beziehen. Die überwiegende Mehrheit von diesen studiert basieren auf TappingMode, Einzelkraft Kurven oder Kraftvolumen Maßen.

TappingMode bietet den Vorteil des Aufwendens des geringfügigen Nominal, der Reibung und der Scherkräfte an, und Phasendarstellung reflektiert die Energie, die zwischen die Spitze und die Probe während jedes Hahns auf der Oberfläche zerstreut wird. Kraftvolumen ist eine andere starke Technik, die auf den Kraftmessungen basiert, die auf einer Grundmasse von den Punkten erzielt werden, die vom Benutzer definiert werden. Steifheit und der Beitritt zwischen der Spitze und der Probe können von jeder Kraftkurve extrahiert werden. Falls die Spitze mit einem Molekül von Zinsen functionalized, können spezifische befreiende Ereignisse auf der Einfahrenkurve auch gekennzeichnet werden. Um diese Engpässe auszugleichen, hat Bruker PeakForce QNM entwickelt.

Einfache, Hochauflösende Quantifikation von BeispielMechanischen Eigenschaften

PeakForce QNM aktiviert direkte Extraktion von quantitativen nanomechanical Informationen von den biologischen Proben, ohne die Probe zu beschädigen. Es hat auf Klopfender Technologie der HöchstKraft, während deren der Fühler in ähnlicher Weise oszilliert wird, während er in TappingMode ist, aber an weit unterhalb der Resonanzfrequenz basiert (1 oder 2 kHz abhängig von dem Hilfsmittel). Jedes Mal wenn die Spitze und die Probe zusammengebracht werden, wird eine Kraftkurve erfasst. Jedoch wo die Rückkopplungsschleife die klopfende Amplitude beibehält, die in TappingMode konstant ist, Klopfende Bediengeräte der HöchstKraft die maximale Höchstkraft auf dem Fühler. Diese Kräfte können als TappingMode sein esteuert auf den Niveaus, die als Kontaktmodus viel niedriger sind und sogar, senken, Operation auf sogar den empfindlichsten biologischen Proben erlaubend.

Abbildung 1 zeigt die verschiedenen Kraftbereiche, die durch den Fühler während einer Anflugeinfahrung Schleife sowie aller Informationen, die, erfahren werden von der erzeugten Kraft extrahiert werden können kurvt. Wenn der Fühler der Probe (Abbildung 1a) sich nähert, hat er in Richtung zur Oberfläche durch Anziehungskräfte, die hauptsächlich haarartig sind, Van Der Waals und elektrostatische Kräfte heruntergezogen. An Punkt B, werden jene negativen Kräfte höher als die Steifheit des Kragbalkens, die die Spitze veranlaßt, zur Oberfläche zu ziehen und in die, Probe einzudrücken dann zu beginnen, bis die Z-Stellung der Modulation sein Maximum erreicht (Punkt C). Diese Stellung stellt den maximalen Höchstkraftwert dar, der für die Regelung verwendet wird. Nach diesem Punkt fängt der Fühler an zurückzutreten, bis er den Zug-weg Punkt erreicht (den maximalen Beitrittspunkt, der auch der minimalen Kraft entspricht). Dann fährt die Spitze fort einzufahren und erreicht zurück zu seiner Ausgangsstellung (e) in der (wie auf A) nicht mehr Kraftgebiet seinen Antrag beeinflußt.

Abbildung 1. Funktionsprinzip von PeakForce QNM. Während der Fühler oszilliert wird, wird eine Kraftkurve für jedes Pixel des Bildes aufgezeichnet. Um zwischen den verschiedenen Teilen der Spitzenflugbahn zu unterscheiden, wurde dieses Beispiel aufgezeichnet indem man einen TAP150A-Fühler verwendete, der gewöhnlich zum steife und schlecht konforme Bild ziemlich Proben verwendet wird. Auf biologischen Proben kann die typische Höchstkraft bis zu tausendmal niedriger sein.

Dieses Mechanikerbaumuster nimmt an, dass das Kontaktprinzip das selbe wie im Hertzschen Baumuster bleibt, aber betrachtet zusätzliche attraktive Interaktionen als fokussiert innerhalb eines Rings, der außerhalb des Kontaktgebiets gelegen ist (Abbildung 2a). In diesem Fall und in Betracht des Kontaktes zwischen einer Kugel und einem elastischen Halbraum, hängt die Kraft mit der Deformation vorbei zusammen:

wo E* das verringerte Elastizitätsmodul, das R der Spitzenradius und das d die Deformationstiefe darstellt.

Schließlich wird die Energie, die durch die Spitze zerstreut werden und die Probe während jedes Hahns auf der Oberfläche erhalten, indem man den Bereich zwischen dem Anflug und den Einfahrenkurven integriert.

Direkte Quantifikation von FLUGHANDBUCH-Signalen auf Biologischen Proben

Wenn der Fühler vor dem Experiment kalibriert wird, sind alle Signale, die oben erwähnt werden, direkt quantitativ. Diese Kalibrierung kann erfolgt sein, wie folgt:

  1. Ziehen Sie ein steifes Teil der Probe (wie Glas) an und zeichnen Sie eine Kraftkurve auf, von der die Ausschlagempfindlichkeit berechnet werden kann.
  2. Entnehmen Sie und berechnen Sie die Federkonstante unter Verwendung „der Thermischen Melodie“.
  3. Zeichnen Sie ein Topographiebild der Tipcheck-Probe auf, um einen Wert des Spitzenradius R. zu erhalten.
  4. Nachdem man den geschätzten R-Wert betreten hat, wird die Deformation auf einer Probe der Wahl eingestellt. Die gescannt zu werden Probe sollte ähnliche mechanische Eigenschaften als die biologische Probe haben, die während des Experimentes nachgeforscht wird.

Auf die meisten geprüften Proben, wurde ein Sneddon-Sitz verwendet, um das Elastizitätsmodul zu extrahieren, indem man sehr eine Feile HSDC (HochgeschwindigkeitsDatenerfassung) auf einer Scan-Zeile an einer hohen Auflösung erfasste. Wenn die Kraft- und Höhenprofile verglichen werden, können die nicht-gewünschten Teile (Kraftkurven erfassten auf einem Teil der Probe, die nicht von den Zinsen ist, wie Glas), manuell ausgeschlossen werden. Die Kurven der restlichen Kraft können als einzelne Feile exportiert werden, nachbearbeitet worden durch ein externes Programm, und das durchschnittliche Elastizitätsmodul kann berechnet werden, indem man verschiedene Kontakttheorien, wie das Sneddon-Baumuster betrachtet.

Diese mechanische Theorie betrachtet den Kontakt zwischen einem elastischen Halbraum, der durch eine steife konische Zahnwalze verformt wird (Abbildung 2b) und bestimmt, dass die Belastung zum Quadrat der Eindringtiefe proportional ist. Die Einrückungstiefe und der Spitzenradius werden vorbei in Verbindung gestanden:

Abbildung 2. Kontaktmechaniker in FLUGHANDBUCH. In a basiert der DMT-Sitz, auf einer Hertzschen Annahme aber gibt an, dass die Beitrittskräfte außerhalb des Kontaktgebiets fokussiert werden. Dieses wird gut Polymeren mit hoher Schreibdichte und schlecht verformbaren Proben angepasst. In b hält der Sneddon-Sitz die Spitze für eine unbegrenzte konische Zahnwalze, die gut den weichen (biologisch) und verformbaren Proben angepasst wird.

Auf solchen Proben sind eine große Auswahl von FLUGHANDBUCH-Fühlern geprüft worden und die Empfehlung wird in Abbildung 3. gegeben. Die weichsten existierenden Fühler auf dem Markt sind OBL-B, die eine nominale Federkonstante von 0,006 N/m haben und folglich angebracht sind, super weiche lebende Zellen nachzuforschen, wie Neuronen.

Abbildung 3. Reichweite der Befolgung der verschiedenen biologischen Proben und entsprechenden DER FLUGHANDBUCH-Fühler empfohlen für das HöchstKraft-Klopfen. Abhängig von ihrem Baumuster können Eukaryoten sehr verschiedene mechanische Eigenschaften aufweisen. Neuronen können extrem weich sein (unten zu 1kPa) während Knochenzelle wie Bakterien so robust sein kann. Um die Zelleigenschaften richtig zu prüfen, die rechte Federkonstante auswählend und folglich ist Empfindlichkeit obligatorisch.

Darstellung Biologische Proben mit PeakForce QNM

Biologische Marineproben werden häufig aus einer Mischung von weichen und steifen Bauteilen verfasst. Eine Probe des Wassers genommen vom Adriatischen Meer wurde auf einen Objektträger gesetzt und nachgeforscht durch PeakForce QNM. Anders als sehr relevante Bemerkungen zu lebenden Diatomeen, wurden einige Zellwandreste auch in der Suspension gefunden. Abbildung 4 nennt ein Beispiel, wie jene Zellen schauen. Das Profil 3D-topography deckt eine charakteristische Waffel ähnliche Zelle mit Poren 100 nm an Größe und eine durchschnittliche Höhe von 20 nm auf. Der Beitrittskanal zeigt einen markierten Kontrast zwischen der Unterseite der Poren (ungefähr 50 pN im Durchschnitt) und dem Rest der Zellwand (weniger als 20 pN). Jedoch sind die informativsten Kanäle die Elastizität und die Deformationsdaten. Auf beiden Kanälen sind die drei Teile des frustule, jedes bemerkenswert, das offenbar verschiedene mechanische Eigenschaften aufweist: die Mitte der Pore (durchschnittliches Elastizitätsmodul von kPa ~300 und von durchschnittlicher Deformation von ~7 nm), der Ring um die Pore (~75 kPa und ~25 nm) und das Kernteil der Zellwand, die scheinen, dazwischenliegende mechanische Eigenschaften zu haben (~200 kPa und ~10 nm).

Abbildung 4. Darstellung der PhytoplanktonZellwand mit einem BioScope-Katalysator FLUGHANDBUCH. Oben links: Elektronenmikroskopiebild einer Diatomee, Beispielhöflichkeit von Dennis Kunkel, Astrographics. Die Meisten Kanäle PeakForce QNM liefern einen bemerkenswerten Kontrast und hochauflösenden Merkmale.

Zusätzliche Experimente wurden auf Bakterien Escherichia Coli K12 durchgeführt. Anders Als die meisten von Escherichia- Colispezies, sind Spannungen K12 in der Lage, im Darm zu multiplizieren und sind gegen Antikörper besonders beständig. Eine ihrer anderen Eigenschaften ist, dass sie pili besitzen (sehen Sie Abbildung 5a), dass gewöhnlich unter Entleerungsbedingungen oder jede mögliche Betonungsumgebung einfahren Sie. Bis jetzt ist Darstellung jene Bakterien, die mit dem FLUGHANDBUCH, in jedem möglichem Modus lebendig sind, eine beträchtliche Herausforderung und ein historisch ausweichendes Ergebnis gewesen.

Abbildung 5 zeigt die hochauflösenden Bilder solcher lebenden Bakterien, leicht erhalten in weniger als einer Stunde. Wie auf dem 3D-representation des Höhenkanals gesehen werden kann (Abbildung 5b), sind das pili nicht mehr sichtbar, das durch die Tatsache erklärt werden kann, dass, extrahierend von ihrem Suspensionsmedium und sie auf einem Teller ausbreitend, einen Druck verursacht, der denen pili veranlaßt einzufahren. Abbildung 5c zeigt den DMT-Modulkanal. Indem man einen Sneddon-Sitz verwendete, wurde das durchschnittliche Elastizitätsmodul bestimmt, um kPa 183 zu sein, das tadellos vorhergehende Beobachtungen übereinstimmt.

Abbildung 5. Bakterien Escherichia Coli K12 abgebildet durch PeakForce QNM auf einem BioScope-Katalysator FLUGHANDBUCH. In a wird die Zelle der Spannung gezeichnet. In b wird eine Darstellung 3D-height FLUGHANDBUCHS 10x10μm eines Clusters der Bakterien gezeigt. In c Elastizitätsmodulkanal (Zschuppe: 0-4GPa) wird dargestellt. Dieses ist das erste mal, dass solche Bakterien durch FLUGHANDBUCH abgebildetes lebendiges gewesen ist.

Überwachung ZellDynamik in der Istzeit

Alle lebenden Zellen sind dynamisch, das Verformen wegen der Neuordnung ihres Cytoskeletongestells und Ausbreiten und Migrieren auf die Zellkultursubstratfläche. Diese Prozesse und die mechanischen Änderungen, die sie begleiten, können unter Verwendung des PeakForce QNM geüberwacht werden. In einem anderen Set Experimenten, wurde PeakForce QNM verwendet, um glioblastoma Zellen nachzuforschen. Glioblastoma sind bei weitem das geläufigste und bösartigste Formular des Hirntumors. Lebende glioblastoma Zellen sind durch PeakForce QNM auf dem BioScope-Katalysator und gewartetes lebendiges während der Zeit des Experimentes unter Anwendung von dem P/IN abgebildet gewesen. Diese Technologie erlaubt dem Benutzer, ein sehr leichtes an der mäßigen Kraft auf der Probe anzuwenden, abhängig von den benötigten Informationen. Wenn man eine sehr helle Kraft auf der Probe aufwendet, können die obersten Merkmale der Zelle (Glycocalyx, Vorsprünge) geprüft werden. Andererseits wird eine etwas höhere Kraft gefordert, um die Organellen und den Cytoskeleton zu ermittlen, die unter die Plasmamembran gelegen sind. Das Prüfen der wirklichen mechanischen Eigenschaften der Probe benötigt auch Einrückung der Probe (und biegen Sie folglich im Kragbalken), durch mindestens hundert nm. Stellen Sie dar, dass Shows 6a, die, ein typisches hochauflösendes Bild auf lebendem glioblastoma beim Aufwenden einer mäßigen Kraft (~300 pN) erreichte.

Abbildung 6. Bilder von lebenden glioblastoma Zellen durch PeakForce QNM und das BioScope-Katalysator FLUGHANDBUCH. In a zeigt das 40x40μm Höhenbild, das an einer mäßigen Kraft aufgezeichnet wird, die obersten und internen Zellen. In b 15x15μm wird Überlagerung 3D von Topographie- und Deformationskanälen gezeigt. Brukers BioScope-Katalysator mit dem Durchströmen des Stufen-Inkubators bietet den besten Ausgleich der lebende Zelldarstellung für langfristige Experimente an.

Keratinocytes sind die Hauptteile der äußersten Schicht der menschlichen Haut. Solche Zellen durch FLUGHANDBUCH-Hilfsforscher Studierend, verstehen Sie den Prozess von Hautkrebs oder von anderen Beeinträchtigungen.

HaCat ist eine unsterbliche Zellform von menschlichen keratinocytes, die breit in der Zytologie nachgeforscht und auch einen guten Kandidaten darstellt wird, um das Potenzial von PeakForce QNM zu erforschen. Die Zellen wurden einem oxydierenden Agens ausgesetzt, das zur Veranlassung eines Druckes fähig ist. In Erwiderung auf diesen chemischen Angriff neigen die Zellen, so genannte Actindruckfasern umzuwandeln und zu synthetisieren. Ein typisches mittleres Auflösungsbild wird in Abbildung 7. gezeigt.

Abbildung 7. 75x75μm BioScope Katalysator und PeakForce QNM Bild von Lebenhacat-Zellen unter oxidativem Stress. Die Zellen reagieren, indem sie schnell Druckfäserchen synthetisieren, um Kontakte mit anliegenden Zellen herzustellen. Solche dynamischen Prozesse können auch aufgespürt werden, indem man diese Technik verwendet.

In PeakForce QNM, wird eine Kraftkurve für jedes Pixel des Bildes gemacht, so ist die Auflösung die selbe auf allen Kanälen. Dieses Beispiel stellt, wie einfach dar und fastet (Auflösungsbilder des Pixels 384x384 können in 6 bis 9 Minuten erfasst werden), es ist zu direkt und in der quantitativen Art ändert ein Fühler in der Topographie und in den mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen in Erwiderung auf medizinische Behandlungen.

BedeckungsFLUGHANDBUCH und Optische Kanäle

Andere der aktuellen Schlüsselherausforderungen für biologische Anwendungen ist, in der Lage zu sein, optische und FLUGHANDBUCH-Informationen gleichzeitig zu erhalten. Brukers kann exklusive Mikroskop-Bild-Registrierungs- und Überlagerungs(MIRO™) Funktion verwendet werden, um die optische/Fluoreszenzbilder in NanoScope®-Software leicht zu importieren und sie mit FLUGHANDBUCH-Bildern zu überlagern. Nach einer kurzen Kalibrierung kann der Benutzer den Einbauort auswählen, um das FLUGHANDBUCH scannen zu lassen. So kann die Probe auf die gewünschte Stellung automatisch verschoben werden und das FLUGHANDBUCH-Bild kann erfasstes Pixel durch Pixel sein, und völlig integriert in das optische Bild.

Abbildung 8 zeigt eine Überlagerung, die auf lebenden endothelial Zellen erzielt wird. Das Fluoreszenzbild (DAPI für Kern und á-phalloidin für Actinfäden doppel-befleckend) wird als der Hintergrund eingestellt und überlappt mit einem FLUGHANDBUCH-Bild, das von einer Mischung von zwei Kanälen gemacht wird: Höchstkraft Fehler und Elastizitätsmodul. Die Transparenz wurde bei 50% eingestellt, damit eine direkte Wechselbeziehung zwischen den verschiedenen Teilen der Zellen (sichtbar durch FLUGHANDBUCHtopographie und -fluoreszenz) und ihren entsprechenden mechanischen Eigenschaften (Elastizitätsmodul FLUGHANDBUCH-Kanal) gemacht werden kann. In b werden c und d der einzelne Höchstkraftfehler, Elastizitätsmodul und Deformation FLUGHANDBUCH-Bilder dargestellt. Es kann in der Elastizität offenbar gesehen werden und Deformationskanäle, die auf den Rändern von Zellen, in denen die Stärke zu niedrig ist, der Einfluss des Gestells (Glas) auf die mechanischen Eigenschaften der Probe nicht geringfügig ist, während auf dem Kernteil der Zellen, das durchschnittliche Elastizitätsmodul (kPa 45,3) viel zuverlässiger ist. Für einen Stoff der Klarheit, werden nur drei FLUGHANDBUCH-Kanäle hier gezeigt, aber acht verschiedene Signale können gleichzeitig angezeigt werden.

Abbildung 8. Überlagerung der Fluoreszenz und FLUGHANDBUCH-Bilder von LebenHUVEC-Zellen erstellt mit MIRO auf einem BioScope-Katalysator. Der Hauptnutzen von MIRO ist, die Bildschirmanzeige von optischen und FLUGHANDBUCH-Informationen gleichzeitig zu aktivieren. Beim Bedienen mit functionalized Fühlern, kann eine „Punkt- u. Trieb“ Option auch verwendet werden, um Kraftmessung an gewünschten Einbauorten genau zu starten, ohne den Ligand zu verlieren.

Schlussfolgerung

Die Anwendungen, die oben gezeigt werden, zeigen, dass das Spitzen-Kraft-Klopfen bei weitem das stärkste ist und der erhältliche heutige Tag quantitativer hochauflösender FLUGHANDBUCH-Technik, zum der quantitativen Chemikalie und der mechanischen Eigenschaften der lebenden biologischen Proben mit einer Datenerfassung zu prüfen vergleichbares mit TappingMode beschleunigen. Die Anzahl von verschiedenen mechanischen Eigenschaften, die gekennzeichnet werden können, überschreitet die anderer allgemein verwendeter FLUGHANDBUCH-Modi. Sein Potenzial ebnet die Methode für viele erregenden Neuanmeldungen auf dem Gebiet der Biologie, besonders in der Krebsforschung und in den Herz-Kreislauf-Erkrankungen.

Über Bruker

Nano-Oberflächen Bruker liefert AtomKraft-Mikroskop-/Scannen-Fühler-Mikroskop(AFM/SPM) Produkte, die heraus von anderen handelsüblichen Anlagen für ihre robuste Auslegung und Benutzerfreundlichkeit stehen, während, die höchste Auflösung beibehalten. Der NANOS-Messkopf, der ein Teil aller unserer Instrumente ist, setzt ein eindeutiges Glasfaserinterferometer für das Messen des freitragenden Ausschlags ein, der macht den Vertrag der Installation so, dass er nicht größer als ein Standardforschungsmikroskoplernziel ist.

Diese Informationen sind Ursprungs- angepasst gewesen, wiederholt und von den Materialien, die von Nano-Oberflächen Bruker bereitgestellt werden.

Zu mehr Information über diese Quelle, besuchen Sie bitte Nano-Oberflächen Bruker.

Date Added: Jun 19, 2012 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:11

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit