Microscopia Atómica de la Fuerza: Proyección De Imagen Cuantitativa de Muestras Biológicas de Vida usando PeakForce QNM

Por AZoNano

Índice

Introducción
Mecánicos del AFM y de la Célula
Cuantificación Fácil, De Alta Resolución de las Propiedades Mecánicas de la Muestra
Cuantificación Directa de las Señales del AFM en Muestras Biológicas
Muestras Biológicas de la Proyección De Imagen con PeakForce QNM
Dinámica de la Célula de la Supervisión en Tiempo Real
AFM de Sobreposición y Canales Ópticos
Conclusión
Sobre Bruker

Introducción

Es un hecho bien conocido de que la determinación de las propiedades mecánicas de células vivas ex vivo puede indicar la salud del organismo de la cual fueron extraídas. Determinado en el modo de la fuerza, el AFM es una herramienta diagnóstica y de investigación potente. La espectroscopia de la Fuerza tiene muchas desventajas tales como menos resolución, velocidad de la adquisición, y no proporciona a la información cuantitativa necesaria. PeakForce QNM ha sido desarrollado por Bruker para ofrecer datos informativos en la alta resolución con facilidad de empleo notable.

Mecánicos del AFM y de la Célula

Desde su revelado, el AFM es una herramienta de la opción a las muestras biológicas del super suave de la imagen, especialmente con la aparición de la espectroscopia de TappingMode™ y de la fuerza y del hecho de que es una de las pocas técnicas de la microscopia que permite la observación de células bajo condiciones cercano-fisiológicas. El AFM es de uso frecuente correlacionar el comportamiento y la migración o la división elástico de la célula. La gran mayoría de éstos estudia se basa en TappingMode, curvas de la único-fuerza, o mediciones del fuerza-volumen.

TappingMode ofrece la ventaja de aplicar fuerzas insignificantes del nominal, de la fricción y de resistencia, y la proyección de imagen de la fase refleja la energía disipada entre la punta y la muestra durante cada golpecito en la superficie. El volumen de la Fuerza es otra técnica potente basada en las mediciones de la fuerza logradas en una matriz de las puntas definidas por el utilizador. La Rigidez y la adherencia entre la punta y la muestra se pueden extraer de cada curva de la fuerza. En caso de que la punta functionalized con una molécula del interés, las acciones de desatadura específicas se pueden también determinar en la curva de la contracción. Para vencer estos atascamientos, Bruker ha desarrollado PeakForce QNM.

Cuantificación Fácil, De Alta Resolución de las Propiedades Mecánicas de la Muestra

PeakForce QNM activa la extracción directa de la información nanomechanical cuantitativa de muestras biológicas sin el daño de la muestra. Tiene sobre la base de la tecnología Que Golpea Ligeramente de la Fuerza Máxima, durante la cual la antena se oscila de manera similar mientras que está en TappingMode, pero en lejos debajo de la frecuencia de la resonancia (1 o 2 kilociclos dependiendo de la herramienta). Cada vez que se reúnen la punta y la muestra, se captura una curva de la fuerza. Sin Embargo, donde el bucle de retroalimentación mantiene la amplitud que golpea ligeramente constante en TappingMode, mandos Que Golpean Ligeramente de la Fuerza Máxima la fuerza máxima máxima en la antena. Estas fuerzas pueden ser controladas en los niveles mucho más inferiores que modo de contacto e incluso bajar que TappingMode permitiendo la operación en incluso las muestras biológicas más delicadas.

El Cuadro 1 muestra los diversos campos de fuerza experimentados por la antena durante un ciclo del aproximación-retractar, así como toda la información que se puede extraer de la fuerza generada curva. Cuando la antena se acerca a la muestra (figura 1a), ha tirado hacia abajo hacia la superficie por las fuerzas atractivas, que son principal capilares, Van der Waals y las fuerzas electroestáticas. En la punta B, esas fuerzas negativas se convierten más arriba que la rigidez del voladizo, que hace la punta tirar a la superficie y después comenzar a mellar en la muestra hasta que la Z-Posición de la modulación alcance su máximo (punta C). Esta posición representa el valor máximo máximo de la fuerza, que se utiliza para el mando de feedback. Después de esta punta, la antena comienza a replegarse hasta que alcance la punta del tirón-lejos (la punta máxima de la adherencia, que también corresponde a la fuerza mínima). Después la punta continúa el retractarse y alcanza de nuevo a su posición original (e) donde (como en A) no más de campo de fuerza afecta a su movimiento.

Cuadro 1. principio de Funcionamiento de PeakForce QNM. Mientras Que se oscila la antena, una curva de la fuerza se registra para cada pixel de la imagen. Para distinguir entre las diversas porciones de la trayectoria de la punta, este ejemplo fue registrado usando una antena de TAP150A, que se utiliza típicamente a la imagen las muestras bastante derechas y mal obedientes. En muestras biológicas, la fuerza máxima típica puede estar hasta mil veces más bajo.

Este modelo de los mecánicos asume que el principio del contacto sigue siendo lo mismo que en el modelo Hertziano pero considera acciones recíprocas atractivas adicionales enfocadas dentro de una pieza anular situada fuera del área de contacto (figura 2a). En ese caso, y en vista del contacto entre una esfera y un medio espacio elástico, la fuerza se relaciona con la deformación cerca:

donde E* representa el módulo, el R el radio de la punta y la d De Young reducidos la profundidad de la deformación.

Eventual, la energía disipada por la punta y la muestra durante cada golpecito en la superficie es obtenida integrando el área entre la aproximación y las curvas de la contracción.

Cuantificación Directa de las Señales del AFM en Muestras Biológicas

Cuando la antena se calibra antes del experimento, todas las señales mencionadas anteriormente serán directamente cuantitativas. Esta calibración puede ser hecha como sigue:

  1. Dedique una parte derecha de la muestra (como el cristal) y registre una curva de la fuerza de la cual la sensibilidad de desviación pueda ser calculada.
  2. Repliegúese y calcule el muelle constante usando “Aire Térmico”.
  3. Registre una imagen de la topografía de la muestra de Tipcheck para obtener un valor del radio R. de la punta.
  4. Después de incorporar el valor estimado de R, la deformación se ajusta en una muestra de la opción. La muestra que se explorará debe tener propiedades mecánicas similares como la muestra biológica que será investigada durante el experimento.

En la mayor parte de las muestras probadas, un ajuste de Sneddon fue utilizado para extraer el módulo De Young capturando un fichero de HSDC (Recogida de Datos De alta velocidad) en una línea de exploración en un muy de alta resolución. Cuando se comparan los perfiles de la fuerza y de la altura, las piezas no-deseadas (las curvas de la fuerza capturaron en una porción de la muestra que no está de interés, tal como cristal) se pueden excluir manualmente. Las curvas de la fuerza restante se pueden exportar como único fichero, postprocesado por un programa externo, y el módulo De Young medio puede ser calculado considerando diversas teorías del contacto, tales como el modelo de Sneddon.

Esta teoría mecánica considera el contacto entre un medio espacio elástico deformado por un penetrador cónico rígido (figura 2b), determinando que la carga es proporcional al cuadrado de la profundidad de penetración. La profundidad del sangrado de márgenes y el radio de la punta se relacionan cerca:

Cuadro 2. mecánicos del Contacto en el AFM. En a, el ajuste del DMT se basa en una suposición Hertziana pero declara que las fuerzas de la adherencia están enfocadas fuera del área de contacto. Esto se adapta bien a los polímeros de alta densidad y a las muestras mal deformables. En b, el ajuste de Sneddon considera la punta como penetrador cónico infinito, que se adapta bien a las muestras suaves (biológico) y deformables.

En tales muestras, se han probado una amplia gama de antenas del AFM y la recomendación se da en el cuadro 3. Las antenas existentes más suaves en el mercado son OBL-B, que tienen un constante nominal del muelle de 0,006 N/m y son así apropiados investigar las células vivas del super suave, tales como neuronas.

Cuadro 3. Rango de la concordancia de diversas muestras biológicas y de antenas correspondientes del AFM recomendadas para Golpear Ligeramente Máximo de la Fuerza. Dependiendo de su tipo, las células eucarióticas pueden exhibir propiedades mecánicas muy diversas. Las Neuronas pueden ser extremadamente suaves (hacia abajo a 1kPa) mientras que la célula de hueso puede ser tan robusta como bacterias. Para sondar correctamente las propiedades de la célula, seleccionando el muelle correcto constante y la sensibilidad es así obligatoria.

Muestras Biológicas de la Proyección De Imagen con PeakForce QNM

Las muestras biológicas Marinas se componen a menudo de una mezcla de componentes suaves y rígidos. Una muestra del agua recogida del Mar Adriático fue puesta en una diapositiva de cristal e investigada por PeakForce QNM. Con excepción de observaciones muy relevantes respecto a diatomeas vivas, algunos remanente de la pared celular también fueron encontrados en la suspensión. El Cuadro 4 da un ejemplo cómo esas estructuras observan. El perfil 3D-topography revela una característica galleta-como la estructura con los poros 100 nanómetro de tamaño y una altura media de 20 nanómetro. El canal de la adherencia muestra un contraste marcado entre la parte inferior de los poros (cerca de 50 pN en promedio) y el descanso de la pared celular (menos de 20 pN). Sin Embargo, los canales más informativos son la elasticidad y los datos de la deformación. En ambos canales las tres porciones del frustule son distinguidas, cada uno que exhibe propiedades mecánicas sin obstrucción diversas: el centro del poro (módulo De Young medio del kPa ~300 y de la deformación media de ~7 nanómetro), el anillo alrededor del poro (~75 kPa y ~25 nanómetro) y la pieza de la base de la pared celular, que parecen tener propiedades mecánicas intermedias (~200 el kPa y ~10 nanómetro).

Cuadro 4. Proyección De Imagen de la pared celular del fitoplacton con un Catalizador AFM del BioScope. Izquierdo Superior: imagen de una diatomea, cortesía de la microscopia electrónica de la muestra de Dennis Kunkel, Astrographics. La mayor parte de los canales de PeakForce QNM proporcionan a un contraste notable y a características de alta resolución.

Los experimentos Adicionales fueron realizados en las bacterias de Escherichia Coli K12. A Diferencia la mayor parte de la especie de Escherichia Coli, las deformaciones K12 pueden multiplicarse en el intestino y son determinado resistentes a los anticuerpos. Una de sus otras características es que poseen pili (véase la figura 5a) que retráctese típicamente bajo condiciones del agotamiento o cualquier ambiente de esfuerzo. Hasta ahora, la proyección de imagen esas bacterias activas con el AFM, en cualquier modo, ha sido un considerable reto y un resultado históricamente evasivo.

El Cuadro 5 muestra las imágenes de alta resolución de tales bacterias vivas, obtenidas fácilmente en menos de una hora. Como puede ser visto en el 3D-representation del canal de la altura (figura 5b), el pili es no más visible, que se puede explicar por el hecho de que extrayendo de su media de la suspensión y extendiéndolo en un plato induce una tensión que haga a ésos pili retractarse. La Figura 5c muestra el canal del módulo del DMT. Usando un ajuste de Sneddon, el módulo De Young medio fue determinado para ser el kPa 183, que corresponde con perfectamente observaciones anteriores.

Cuadro 5. bacterias de Escherichia Coli K12 reflejadas por PeakForce QNM en un Catalizador AFM del BioScope. En a, la estructura de la deformación se drena. En b, una representación 3D-height del AFM el 10x10μm de un atado de bacterias se muestra. En c, canal De Young del módulo (z-escala: se representa 0-4GPa). Éste es la primera vez que tales bacterias han estado activas reflejado por el AFM.

Dinámica de la Célula de la Supervisión en Tiempo Real

Todas Las células vivas son dinámicas, desformación debido al cambio de su andamio del citoesqueleto y el extenderse y migración en el substrato del cultivo celular. Estos procesos y los cambios mecánicos que los acompañan se pueden vigilar usando el PeakForce QNM. En otro conjunto de experimentos, PeakForce QNM fue utilizado para investigar las células del glioblastoma. Glioblastoma es con mucho el formulario más común y más malo del cáncer de cerebro. Las células Vivas del glioblastoma han sido reflejadas por PeakForce QNM en el Catalizador del BioScope y activo mantenida por la época del experimento por el uso de la PSI. Esta tecnología permite que el utilizador aplique un muy apacible a la fuerza moderada en la muestra, dependiendo de la información necesaria. Al aplicar una fuerza muy pálida en la muestra, las características superiores de la célula (glycocalyx, protuberancias) pueden ser sondadas. Por otra parte, una fuerza ligeramente más alta se requiere para detectar los organelos y el citoesqueleto situados por debajo la membrana de plasma. El Sondeo de las propiedades mecánicas reales de la muestra también requiere el sangrado de márgenes de la muestra (y doble así en el voladizo) por por lo menos cientos nanómetros. Figure que demostraciones 6a que una imagen de alta resolución típica obtuvo en glioblastoma vivo mientras que aplicaba una fuerza moderada (~300 pN).

Cuadro 6. Imágenes de las células vivas del glioblastoma por PeakForce QNM y el Catalizador AFM del BioScope. En a, la imagen de la altura de los 40x40μm registrada en una fuerza moderada muestra las estructuras superiores e internas. En b, el papel 3D del 15x15μm de los canales de la topografía y de la deformación se muestra. El Catalizador del BioScope de Bruker con la Perfusión de la Incubadora del Escenario ofrece el mejor equilibrio de la proyección de imagen de la célula viva para los experimentos a largo plazo.

Keratinocytes es los componentes mayores de la capa exterior de la piel humana. Estudiando tales células de los investigadores de las ayudas del AFM entienda el proceso del cáncer de piel o de otras debilitaciones.

HaCat es una variedad de células inmortal de keratinocytes humanos que se investiga extensamente en citología y también representa a un buen candidato para explorar el potencial de PeakForce QNM. Las células fueron expuestas a un agente oxidativo capaz de inducir una tensión. En respuesta a esta agresión química, las células tienden a transformar y a sintetizar supuestas fibras de tensión de la actinia. Una imagen de resolución media típica se muestra en el cuadro 7.

Cuadro 7. imagen del Catalizador y de PeakForce QNM del BioScope de los 75x75μm de las células de vida de HaCat bajo tensión oxidativa. Las células reaccionan rápidamente sintetizando las fibrillas de la tensión para establecer contactos con las células adyacentes. Tales procesos dinámicos se pueden también seguir su trayectoria usando esta técnica.

En PeakForce QNM, una curva de la fuerza se hace para cada pixel de la imagen, así la resolución está lo mismo en todos los canales. Este ejemplo ilustra cómo es fácil y ayuna (las imágenes de los píxeles de resolución 384x384 se pueden capturar en 6 a 9 minutos) él está a directamente y de manera cuantitativa una antena cambia en topografía y propiedades mecánicas de células vivas en respuesta a tratamientos de la droga.

AFM de Sobreposición y Canales Ópticos

Otros de los retos dominantes actuales para las aplicaciones biológicas son poder conseguir información óptica y del AFM simultáneamente. La característica exclusiva de la Inscripción y del Papel de la Imagen del Microscopio de Bruker (MIRO™) se puede utilizar para importar fácilmente imágenes ópticas/de la fluorescencia en el software de NanoScope® y para cubrirlas con imágenes del AFM. Después de una calibración corta, el utilizador puede seleccionar la ubicación para hacer que el AFM explora. Así la muestra se puede mover automáticamente a la posición deseada y la imagen del AFM puede ser pixel capturado por el pixel, e integrado completo en la imagen óptica.

El Cuadro 8 muestra un papel logrado en las células endoteliales de vida. La imagen de la fluorescencia (doble-manchando DAPI para el núcleo y el á-phalloidin para los filamentos de la actinia) se fija como los antecedentes y se traslapa con una imagen del AFM hecha de una mezcla de dos canales: desvío máximo de la fuerza y módulo De Young. La diapositiva fue fijada en el 50% para poder hacer una correlación directa entre las diversas partes de las células (visibles por topografía y fluorescencia del AFM) y sus propiedades mecánicas correspondientes (canal De Young del AFM del módulo). En b, se representan c y d el desvío máximo individual de la fuerza, el módulo De Young y las imágenes del AFM de la deformación. Puede ser visto sin obstrucción en la elasticidad y los canales de la deformación que en los bordes de células donde está demasiado bajo el espesor, la influencia del andamio (cristal) en las propiedades mecánicas de la muestra son no insignificantes, mientras que en la pieza de la base de las células, el módulo De Young medio es mucho más seguro (el kPa 45,3). Para una cuestión de claridad, solamente tres canales del AFM se muestran aquí, pero ocho diversas señales se pueden visualizar simultáneamente.

Cuadro 8. Papel de la fluorescencia e imágenes del AFM de las células de vida de HUVEC creadas con MIRO en un Catalizador del BioScope. La ventaja principal de MIRO es activar la visualización de la información óptica y del AFM simultáneamente. Al operatorio con las antenas functionalized, una opción de la “Punta y del Lanzamiento” se puede también utilizar para accionar exactamente la medición de la fuerza en las ubicaciones deseadas sin perder el ligand.

Conclusión

Las aplicaciones mostradas arriba demuestran que el Golpear Ligeramente de la Fuerza del Pico es con mucho el más potente y el hoy disponible de la técnica de alta resolución cuantitativa del AFM para sondar la substancia química cuantitativa y las propiedades mecánicas de muestras biológicas de vida con una adquisición apresura comparable a TappingMode. El número de diversas propiedades mecánicas que puedan ser caracterizadas excede el de otros modos de uso general del AFM. Su potencial pavimenta la manera para muchas nuevas aplicaciones emocionantes en el campo de la biología, especialmente en la investigación de cáncer y enfermedades cardiovasculares.

Sobre Bruker

Las Superficies Nanas de Bruker proporcionan a los productos Atómicos del Microscopio de la Fuerza/del Microscopio de la Antena de la Exploración (AFM/SPM) que se destacan de otros sistemas disponibles en el comercio para su diseño y facilidad de empleo robustos, mientras que mantiene el más de alta resolución. La carga de medición de NANOS, que es parte de todos nuestros instrumentos, emplea un interferómetro fibroóptico único para medir la desviación voladiza, que hace el compacto del ajuste tan que es no más grande que un objetivo estándar del microscopio de la investigación.

Esta información ha sido originaria, revisada y adaptada de los materiales proporcionados por las Superficies Nanas de Bruker.

Para más información sobre esta fuente, visite por favor las Superficies Nanas de Bruker.

Date Added: Jun 19, 2012 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:29

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