De Atoom Microscopie van de Kracht: Kwantitatieve Weergave van het Leven Biologische Steekproeven die PeakForce QNM gebruiken

Door AZoNano

Inhoudstafel

Inleiding
De Werktuigkundigen van AFM en van de Cel
Gemakkelijke, High-Resolution Getalsmatige Weergave van de Mechanische Eigenschappen van de Steekproef
Directe Getalsmatige Weergave van Signalen AFM op Biologische Steekproeven
De Biologische Steekproeven van de Weergave met PeakForce QNM
De Dynamica van de Cel van de Controle in Echt - tijd
Het Bedekken van AFM en Optische Kanalen
Conclusie
Ongeveer Bruker

Inleiding

Het is een bekend feit dat het bepalen van de mechanische eigenschappen van levende cellen ex vivo op de gezondheid van het organisme kan wijzen waaruit zij werden gehaald. In Het Bijzonder op de krachtwijze, is AFM een krachtig kenmerkend en onderzoekshulpmiddel. De spectroscopie van de Kracht heeft heel wat nadelen zoals minder resolutie, snelheid van aanwinst, en het verstrekt niet de nodig kwantitatieve informatie. PeakForce QNM is ontwikkeld door Bruker om informatieve gegevens bij hoge resolutie met opmerkelijke handigheid aan te bieden.

De Werktuigkundigen van AFM en van de Cel

Sinds zijn ontwikkeling, is AFM een hulpmiddel van keus aan beeld super zachte biologische steekproeven, vooral met de totstandkoming van de spectroscopie en het feit dat van TappingMode™ en van de kracht het één van de weinig de microscopietechnieken is die observatie van cellen in de dichtbijgelegen-fysiologische omstandigheden toestaat. AFM wordt vaak gebruikt om elastische gedrag en celmigratie of afdeling te correleren. De overgrote meerderheid van deze studies is gebaseerd op TappingMode, enig-krachtkrommen, of kracht-volume metingen.

TappingMode biedt het voordeel om te verwaarlozen nominale, wrijvings en scheerbeurtkrachten toe te passen aan, en de faseweergave wijst op de energie die tussen het uiteinde en de steekproef tijdens elke kraan op de oppervlakte wordt verdreven. Het volume van de Kracht is een andere krachtige die techniek op krachtmetingen wordt gebaseerd bereikte die op een matrijs van punten door de gebruiker worden bepaald. De Stijfheid en de adhesie tussen het uiteinde en de steekproef kunnen uit elke krachtkromme worden gehaald. Voor het geval dat het uiteinde functionalized met een molecule van belang is, kunnen de specifieke losmakende gebeurtenissen ook op de intrekkenkromme worden geïdentificeerd. Om deze knelpunten te overwinnen, heeft Bruker PeakForce QNM ontwikkeld.

Gemakkelijke, High-Resolution Getalsmatige Weergave van de Mechanische Eigenschappen van de Steekproef

PeakForce QNM laat directe extractie van kwantitatieve nanomechanical informatie van biologische steekproeven zonder de steekproef toe te beschadigen. Het heeft gebaseerd op PiekKracht Onttrekkend technologie, waarin de sonde op een gelijkaardige manier wordt geoscilleerd aangezien het in TappingMode, maar bij ver onder de resonantiefrequentie is (kHz 1 of 2 afhankelijk van het hulpmiddel). Telkens als het uiteinde en de steekproef worden samengebracht, wordt een krachtkromme gevangen. Nochtans, waar terugkoppel handhaaft de lijn de het onttrekken omvang constant in TappingMode, PiekKracht die controles Onttrekt de maximum piekkracht op de sonde. Deze krachten kunnen op niveaus veel worden gecontroleerd lager dan contacteren wijze en nog lager dan TappingMode toestaand verrichting op zelfs de gevoeligste biologische steekproeven.

Figuur 1 toont de verschillende die krachtgebieden door de sonde tijdens worden ervaren cyclus, evenals al informatie benadering-intrekken die uit de geproduceerde krachtkrommen kunnen worden gehaald. Wanneer de sonde de steekproef (cijfer 1a) nadert, heeft het neer naar de oppervlakte door aantrekkingskracht getrokken, die hoofdzakelijk capillair, Van der Waals en elektrostatische krachten is. Op punt B, worden die negatieve krachten hoger dan de stijfheid van de cantilever, die het uiteinde om aan de oppervlakte veroorzaakt te trekken en dan te beginnen in de steekproef te kartelen tot de z-Positie van de modulatie zijn maximum (punt C) bereikt. Deze positie vertegenwoordigt de maximum piekkrachtwaarde, die voor terugkoppelt controle wordt gebruikt. Na dit punt, begint de sonde zich terug te trekken tot het het pull-off punt bereikt (het maximumadhesiepunt, dat ook aan de minimumkracht beantwoordt). Dan blijft het uiteinde intrekkend en bereikt terug naar zijn originele positie (e) waar (zoals in A) niet meer krachtgebied zijn motie beïnvloedt.

Figuur 1. Het Werk principe van PeakForce QNM. Terwijl de sonde wordt geoscilleerd, wordt een krachtkromme geregistreerd voor elk pixel van het beeld. Om tussen de verschillende gedeelten van de uiteindebaan onderscheid te maken, werd dit voorbeeld geregistreerd door een sonde te gebruiken TAP150A, die typisch aan beeld eerder stijve en slecht volgzame steekproeven wordt gebruikt. Voor biologische steekproeven, kan de typische piekkracht tot duizend keer lager zijn.

Dit werktuigkundigenmodel veronderstelt dat het contactprincipe blijft het zelfde als in het Draadloze model maar extra aantrekkelijke die interactie overweegt binnen annulus worden geconcentreerd buiten het contactgebied wordt gevestigd (cijfer 2a). In dat geval, en het overwegen van het contact tussen een gebied en een elastische halve ruimte, wordt de kracht betrekking gehad op de misvorming door:

waar E* de verminderde modulus, R de uiteindestraal en D van de Jongelui de misvormingsdiepte vertegenwoordigt.

Uiteindelijk, worden de energie door het uiteinde wordt verdreven en de steekproef tijdens elke kraan op de oppervlakte verkregen door het gebied tussen de benadering en de intrekkenkrommen te integreren die.

Directe Getalsmatige Weergave van Signalen AFM op Biologische Steekproeven

Wanneer de sonde voorafgaand aan het experiment wordt gekalibreerd, zullen alle hierboven vermelde signalen direct kwantitatief zijn. Deze kaliberbepaling kan als volgt worden gedaan:

  1. Neem een stijf deel van de steekproef (als glas) in dienst en registreer een krachtkromme waarvanaf de afbuigingsgevoeligheid kan worden berekend.
  2. Trek en bereken de lente terug het constante Thermisch gebruiken „Stemt“.
  3. Registreer een topografiebeeld van de steekproef Tipcheck om een waarde van de uiteindestraal R. te verkrijgen.
  4. Na het ingaan van de geschatte waarde van R, wordt de misvorming aangepast op een steekproef van keus. De af te tasten steekproef zou gelijkaardige mechanische eigenschappen als de biologische steekproef moeten hebben die tijdens het experiment zal worden onderzocht.

Op de meeste geteste steekproeven, werd een pasvorm Sneddon gebruikt om de modulus van de Jongelui te halen door een (de Vangst van de Gegevens van de Hoge Snelheid) dossier HSDC op een aftastenlijn bij een zeer hoge resolutie te vangen. Wanneer de kracht en hoogteprofielen worden vergeleken, kunnen de niet-gewenste die delen (krachtkrommen op een gedeelte van de steekproef die niet van belang worden gevangen is, zoals glas) manueel worden uitgesloten. De resterende krachtkrommen kunnen als één enkel die dossier worden uitgevoerd, door een extern programma wordt post-verwerkt, en de modulus van de gemiddelde Jongelui kan worden berekend door verschillende contacttheorieën, zoals het model te overwegen Sneddon.

Deze mechanische theorie overweegt het contact tussen een elastische die halve ruimte door stijve kegelindenter (cijfer 2b) wordt misvormd, bepalend dat de lading aan het vierkant van de penetratiediepte evenredig is. De inkepingsdiepte en de uiteindestraal worden met elkaar in verband gebracht door:

Figuur 2. De werktuigkundigen van het Contact in AFM. In a, is de DMT pasvorm gebaseerd op een Draadloze veronderstelling maar verklaart dat de adhesiekrachten buiten het contactgebied worden geconcentreerd. Dit wordt goed aangepast aan high-density polymeren en slecht vervormbare steekproeven. In B, beschouwt de pasvorm Sneddon het uiteinde als oneindige kegelindenter, die goed wordt aangepast aan zachte (biologisch) en vervormbare steekproeven.

Voor dergelijke steekproeven, is een brede waaier van sondes AFM getest en de aanbeveling wordt gegeven in figuur 3. De zachtste bestaande sondes op de markt zijn obl-B, die de nominale lente constant van 0.006 N/m hebben en zo aangewezen zijn om super zachte levende cellen, zoals neuronen te onderzoeken.

Figuur 3. Waaier van naleving van diverse biologische steekproeven en overeenkomstige die sondes AFM voor het Piek Onttrekken van de Kracht worden geadviseerd. Afhankelijk van hun type, kunnen eukaryotic cellen zeer verschillende mechanische eigenschappen tentoonstellen. De Neuronen kunnen uiterst zacht zijn (onderaan aan 1kPa) terwijl de beencel zo robuust kan zijn zoals bacteriën. om de celeigenschappen behoorlijk te sonderen, is selecteren van de juiste de lenteconstante en zo de gevoeligheid verplicht.

De Biologische Steekproeven van de Weergave met PeakForce QNM

De Mariene biologische steekproeven zijn vaak samengesteld uit een mengsel van zachte en stijve componenten. Een steekproef van water uit het Adriatische Overzees werd wordt genomen gezet op een glasplaatje dat en werd onderzocht door PeakForce QNM. Buiten zeer relevante observaties op het leven diatomeeën, werden sommige celwandresten ook gevonden in de opschorting. Figuur 4 geeft een voorbeeld hoe die structuren eruit zien. Het 3D-topografieprofiel openbaart een kenmerkende wafel-als structuur met poriën 100 NM in grootte en een gemiddelde hoogte van 20 NM. Het adhesiekanaal toont een duidelijk contrast tussen de bodem van de poriën (ongeveer 50 pN in gemiddelde) en de rest van de celwand (minder dan 20 pN). Nochtans, zijn de meest informatieve kanalen de elasticiteit en de misvormingsgegevens. Op beide kanalen worden de drie gedeelten van frustule onderscheiden, elk die duidelijk verschillende mechanische eigenschappen tentoonstelt: het centrum van de porie (de modulus van gemiddelde Jongelui van ~300 kPa en gemiddelde misvorming van ~7 NM), de ring rond de porie (~75 kPa en ~25 NM) en het kerndeel van de celwand, die schijnt om midden mechanische eigenschappen (~200 kPa en ~10 NM) te hebben.

Figuur 4. Weergave van fytoplanktoncelwand met een BioScope Katalysator AFM. Hoogste linkerzijde: elektronenmicroscopiebeeld van diatomeeën, steekproefhoffelijkheid van Dennis Kunkel, Astrographics. De Meeste kanalen van PeakForce QNM verstrekken een opmerkelijk contrast en high-resolution eigenschappen.

De Extra experimenten werden uitgevoerd op de bacteriën van Escherichia coli K12. In Tegenstelling Tot de meesten van de species van E. coli, K12 de spanningen kunnen zich in de darm vermenigvuldigen en zijn bijzonder bestand tegen antilichamen. Één van hun andere kenmerken is dat zij pili (zie cijfer 5a) bezitten die typisch onder uitputtingsvoorwaarden of om het even welk het beklemtonen milieu intrekken. Tot nu toe, is de weergave die bacteriën levend met AFM, op om het even welke wijze, een aanzienlijke uitdaging en een historisch ontwijkend resultaat geweest.

Figuur 5 toont high-resolution beelden van dergelijke die het leven bacteriën, gemakkelijk in minder dan één uur worden verkregen. Zoals op de 3D-vertegenwoordiging van het hoogtekanaal (figuur 5b) kan worden gezien, is pili niet meer zichtbaar, wat kan worden verklaard door het feit dat halend uit hun opschorting het middel en uitspreidend hen op een schotel een spanning veroorzaakt die die pili om veroorzaakt in te trekken. Het Cijfer 5c toont het DMT moduluskanaal. Door een pasvorm te gebruiken Sneddon, werd de modulus van de gemiddelde Jongelui bepaald om kPa te zijn 183, die volkomen vorige observaties aanpast.

Figuur 5. E. Coli K12 bacteriën imaged door PeakForce QNM op een BioScope Katalysator AFM. In a, wordt de structuur van de spanning getrokken. In B, wordt een AFM 10x10μm 3D-hoogtevertegenwoordiging van een cluster van bacteriën getoond. In c, de moduluskanaal van Jongelui (z-schaal: 0-4GPa) wordt afgeschilderd. Dit is de eerste keer dat dergelijke bacteriën imaged in leven door AFM is geweest.

De Dynamica van de Cel van de Controle in Echt - tijd

Alle levende cellen zijn dynamisch, van vorm veranderen wegens herschikking van hun cytoskeleton steiger en het uitspreiden en het migreren op het substraat van de celcultuur. Deze processen en mechanische veranderingen die hen begeleiden kunnen worden gecontroleerd gebruikend PeakForce QNM. In een andere reeks experimenten, werd PeakForce QNM gebruikt om glioblastomacellen te onderzoeken. Glioblastoma is veruit de gemeenschappelijkste en kwaadaardige vorm van hersenenkanker. De Levende glioblastomacellen zijn imaged door PeakForce QNM op de Katalysator BioScope en gehandhaafde levend voor de tijd van het experiment door het gebruik van PSI geweest. Deze technologie maakt de gebruiker het mogelijk om een zeer zachte aan gematigde kracht op de steekproef, afhankelijk van de nodig informatie toe te passen. Wanneer het toepassen van een zeer lichte kracht op de steekproef, kunnen de hoogste eigenschappen van de cel (glycocalyx, uitsteeksels) worden gesondeerd. Anderzijds, wordt een lichtjes hogere kracht vereist die de organellen en cytoskeleton te ontdekken onderaan het plasmamembraan worden gevestigd. Het Sonderen van de echte mechanische eigenschappen van de steekproef vereist ook inkeping van de steekproef (en zo flex in de cantilever) door minstens honderd NM. Het Cijfer 6a toont een typisch die high-resolution beeld op het leven glioblastoma wordt verkregen terwijl het toepassen van een gematigde kracht (~300 pN).

Figuur 6. Beelden van levende glioblastomacellen door PeakForce QNM en de BioScope Katalysator AFM. In a, 40x40μm toont het hoogtebeeld bij een gematigde kracht wordt geregistreerd zowel hoogste als interne structuren die. In B, 15x15μm wordt 3D bekleding van topografie en misvormingskanalen getoond. De Katalysator van BioScope van Bruker met het Doortrekken van de Incubator van het Stadium biedt het beste saldo van het leven celweergave voor aan experimenten op lange termijn.

Keratinocytes is de belangrijkste componenten van de buitenste laag van de menselijke huid. Het Bestuderen van dergelijke cellen door AFM helpt onderzoekers het proces van huidkanker of andere impairments begrijpen.

HaCat is een onsterfelijke cellenvariëteit van menselijke keratinocytes die wijd in cytologie wordt onderzocht en ook een goede kandidaat vertegenwoordigt om het potentieel van PeakForce QNM te onderzoeken. De cellen werden blootgesteld aan een oxydatieve agent geschikt om een spanning te veroorzaken. In antwoord op deze chemische agressie, neigen de cellen om zogenaamde actin spanningsvezels om te zetten en samen te stellen. Een typisch middelgroot resolutiebeeld wordt getoond in figuur 7.

Figuur 7. 75x75μm Katalysator BioScope en het beeld van PeakForce QNM van levende cellen HaCat onder oxydatieve spanning. De cellen reageren door spanningsfibrillen snel samen te stellen om contacten met aangrenzende cellen te vestigen. Dergelijke dynamische processen kunnen ook worden gevolgd door deze techniek te gebruiken.

In PeakForce QNM, wordt een krachtkromme gemaakt voor elk pixel van het beeld, dus is de resolutie het zelfde op alle kanalen. Dit voorbeeld illustreert hoe gemakkelijk en snel (kunnen de beelden van de 384x384- pixelresolutie in 6 tot 9 minuten worden gevangen) het aan direct en in veranderingen van een de kwantitatieve maniersonde in topografie en mechanische eigenschappen van levende cellen in antwoord op drugbehandelingen is.

Het Bedekken van AFM en Optische Kanalen

Een Andere van de huidige belangrijkste uitdagingen voor biologische toepassingen is gelijktijdig optisch te kunnen worden en informatie AFM. Registratie van het Beeld van de Microscoop van Bruker kunnen de de exclusieve eigenschap en van de Bekleding (MIRO™) worden gebruikt om optische/fluorescentiebeelden gemakkelijk in te voeren in software NanoScope® en hen te bedekken met beelden AFM. Na een korte kaliberbepaling, kan de gebruiker de plaats selecteren om het aftasten te maken AFM. Aldus kan de steekproef automatisch in de gewenste positie worden verplaatst en het beeld AFM kan gevangen pixel door pixel zijn, en volledig geïntegreerd in het optische beeld.

Figuur 8 toont een bekleding bereikte op levende endothelial cellen. Het fluorescentiebeeld (dubbel-bevlekkend DAPI voor kern en á-phalloidin voor actin gloeidraden) wordt geplaatst als achtergrond en die met een beeld AFM van een mengeling van twee kanalen overlapt wordt gemaakt: piek krachtfout en de modulus van Jongelui. De transparantie werd geplaatst bij 50% zodat een directe correlatie tussen de verschillende delen van de cellen (zichtbaar door AFM topografie en fluorescentie) en hun overeenkomstige mechanische eigenschappen (de modulusAFM kanaal van Jongelui) kan worden gemaakt. In B, worden c en D de de individuele piekkrachtfout, modulus van Jongelui en de misvormingsAFM beelden vertegenwoordigd. Het kan duidelijk in de elasticiteit worden gezien en de misvormingskanalen die op de randen van cellen waar de dikte te laag is, de invloed van de steiger (glas) op de mechanische eigenschappen van de steekproef is niet te verwaarlozen, terwijl op het kerndeel van de cellen, de modulus van de gemiddelde Jongelui betrouwbaarder is (kPa 45.3). Voor een kwestie van duidelijkheid, worden slechts drie kanalen AFM hier getoond, maar acht verschillende signalen kunnen gelijktijdig worden getoond.

Figuur 8. De Bekleding van fluorescentie en beelden AFM van levende cellen HUVEC leidde tot met MIRO op een Katalysator BioScope. Het belangrijkste voordeel van MIRO moet de vertoning van optisch en informatie gelijktijdig toelaten AFM. Toen het werken met functionalized sondes, kan een optie van het „Punt & van de Spruit“ ook worden gebruikt om krachtmeting bij gewenste plaatsen nauwkeurig teweeg te brengen zonder ligand te verliezen.

Conclusie

De hierboven getoonde toepassingen tonen aan dat het Piek Onttrekken van de Kracht veruit de krachtigste en kwantitatieve high-resolution techniek AFM vandaag beschikbaar aan sonde kwantitatieve chemische en mechanische eigenschappen van het leven biologische steekproeven met een aanwinstensnelheid vergelijkbaar met TappingMode is. Het aantal verschillende mechanische eigenschappen die kunnen worden gekenmerkt overschrijdt dat van andere algemeen gebruikte wijzen AFM. Zijn potentieel baant de weg voor vele opwindende nieuwe toepassingen op het gebied van biologie, vooral in kankeronderzoek en cardiovasculaire ziekten.

Ongeveer Bruker

Verstrekt Nano Oppervlakten van Bruker de Atoomproducten van de Kracht van de Microscoop/van de Microscoop van de Sonde van het Aftasten (AFM/SPM) die van andere in de handel verkrijgbare systemen voor hun robuuste ontwerp en handigheid, terwijl het handhaven van de hoogste resolutie duidelijk uitkomen. NANOS die hoofd meet, dat deel al onze instrumenten uitmaakt, wendt een unieke vezeloptische interferometer voor het meten van de cantileverafbuiging aan, die de opstelling zo compact maakt dat het neen groter is dan een standaarddoelstelling van de onderzoekmicroscoop.

Deze informatie is afkomstig geweest, herzien en die van materialen door Bruker Nano Oppervlakten aangepast worden verstrekt.

Voor meer informatie over deze bron, te bezoeken gelieve Nano Oppervlakten Bruker.

Date Added: Jun 19, 2012 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:07

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit